Name: fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-04-21T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

يقر M.-H.K.، S.K.، M.L.، و J.P. بالدعم المالي المقدم من معهد العلوم الأساسية (رقم المنحة. IBS-R006-D1). تعترف S.K. ، M.L. ، و J.P. بالدعم المالي المقدم من برنامج الباحثين المبدعين الرائدين من خلال جامعة سيول الوطنية (2021) ومنحة NRF الممولة من الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة. NRF-2020R1A2C2101871 ، و NRF-2021M3A9I4022936). M.L. و J.P. يقترفان بالدعم المالي المقدم من زمالة POSCO للعلوم التابعة لمؤسسة POSCO TJ Park ومنحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2017R1A5A1015365). يقر J.P. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1A6C101A183)، وبرامج المبادرات البحثية متعددة التخصصات من قبل كلية الهندسة وكلية الطب، جامعة سيول الوطنية (2021). يقر M.-H.K. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1I1A1A0107416612). يشكر المؤلفون موظفي وطاقم مركز جامعة سيول الوطنية للتصوير الجزيئي والخلوي (SNU CMCI) على جهودهم الدؤوبة ومثابرتهم في تجارب cryo-EM. يشكر المؤلفون S. J. Kim من المركز الوطني لمرافق البحوث المشتركة بين الجامعات للمساعدة في تجارب FIB-SEM.

1. تصنيع رقاقة صغيرة مع نوافذ GO (الشكل 1)
<ol><li>إيداع نيتريد السيليكون.<ol><li>ترسب نيتريد السيليكون منخفض الضغط (SixN y) على جانبي رقاقة Si (قطرها 4 بوصاتوسماكة 100 ميكرومتر) باستخدام ترسب بخار كيميائي منخفض الضغط (LPCVD) عند 830 درجة مئوية وضغط 150 mTorr ، تحت تدف...

<ol>
	<li>Dillard, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+at+the+cutting+edge+of+cryo-electron+microscopy.">Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+improve+protein+distribution+on+holey+carbon+cryo-EM+supports.">Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Xu, B. J., Developments Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications,+and+prospects+of+cryo-electron+microscopy.">applications, and prospects of cryo-electron microscopy.</a> Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>Darrow, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chameleon:+next+generation+sample+preparation+for+cryoEM+based+on+spotiton.">Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton.</a> Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).</li><li>Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+gating+the+high-conductance+Ca2+-activated+K++channel.">Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel.</a> Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+activated+GLP-1+receptor+in+complex+with+a+G+protein.">Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein.</a> Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).</li><li>Shaik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+coreceptor+recognition+by+HIV-1+envelope+spike.">Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike.</a> Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+inactivated+SARS-CoV-2+with+postfusion+spikes+revealed+by+cryo-EM+and+cryo-ET.">The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET.</a> Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).</li><li>Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+energy+materials+by+cryogenic+electron+microscopy.">Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy.</a> Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).</li><li>Li, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+sensitive+battery+materials+and+Interfaces+revealed+by+cryo-electron+microscopy.">Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy.</a> Science. 358 (6362), 506-510 (2017).</li><li>Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience.">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+synthesis+of+palladium+species+confined+in+a+small-pore+zeolite+via+full+ion-exchange+investigated+by+cryogenic+electron+microscopy.">Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).</li><li>Baumgartner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+growth+of+magnetite+from+solution.">Nucleation and growth of magnetite from solution.</a> Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).</li><li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids.">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Kang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide-supported+microwell+grids+for+preparing+cryo-EM+samples+with+controlled+ice+thickness.">Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).</li><li>Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+safe+graphene+preparation+on+solution+based+platform.">Facile and safe graphene preparation on solution based platform.</a> Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).</li><li>Yang, C., Pham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+study+of+silicon+nitride+films+deposited+by+LPCVD+and+PECVD.">Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD.</a> Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).</li><li>Olson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+LPCVD+process+conditions+for+the+deposition+of+low+stress+silicon+nitride.+Part+I:+preliminary+LPCVD+experiments.">Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments.</a> Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).</li><li>Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+low+stress+silicon+nitride+thin+film+and+its+application+in+surface+micromachining+device+structures.">Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures.</a> Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).</li><li>Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrostatic+actuator+for+fatigue+testing+of+low-stress+LPCVD+silicon+nitride+thin+films.">An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).</li><li>Shafikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+ultrathin+Si3N4+membranes+by+compressive+surface+stress.">Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).</li><li>Ng, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+and+modelling+the+wetting+properties+of+III-V+semiconductor+surfaces+using+re-entrant+nanostructures.">Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures.</a> Scientific Reports. 8, 3544 (2018).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-templated+silver+nanoparticle+arrays+photopolymerized+in+zero-mode+waveguides.">Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides.</a> Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).</li><li>Escobedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+nanohole+array+based+sensing:+a+review.">On-chip nanohole array based sensing: a review.</a> Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).</li></ol>

يتم تقديم عمليات التصنيع الدقيق لإنتاج رقائق صغيرة مع نوافذ GO هنا. تم تصميم الشريحة الدقيقة المصنعة لتنظيم سمك طبقة الجليد الزجاجية من خلال التحكم في عمق الثقب الصغير باستخدام نوافذ GO اعتمادا على حجم المادة المراد تحليلها. تم تصنيع شريحة صغيرة النقوش مع نوافذ GO باستخدام سلسلة من تقنيات MEMS...

تم تطوير المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للبروتينات في حالتها الأصلية1،2،3،4. تتضمن هذه التقنية تثبيت البروتينات في طبقة رقيقة (10-100 نانومتر) من الجليد الزجاجي والحصول على صور إسقاط للبروتينات الموجهة عشوائيا باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، مع الحفاظ على العينة عند درجة حرارة النيتروجين السائل. يتم الحصول على الآلاف إلى الملايين من صور الإسقاط واستخدامها لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين بواسطة خوارزميات حسابية 5,6. للحصول على تحليل ناجح باستخدام cryo-EM ، تم أتمتة إعداد عينات التبريد عن طريق تجميد المعدات التي تتحكم في ظروف النشاف والرطوبة ودرجة الحرارة. يتم تحميل محلول العينة على شبكة TEM بغشاء كربوني هولي ، ويتم لطخه على التوالي لإزالة المحلول الزائد ، ثم يتم تجميده بالإيثان السائل لإنتاج جليد زجاجي رقيق 1,5,6. مع التقدم في cryo-EM وأتمتة إعداد العينات7 ، تم استخدام cryo-EM بشكل متزايد لحل بنية البروتينات ، بما في ذلك البروتينات المغلفة للفيروسات وبروتينات القناة الأيونية في غشاء الخلية 8,9,10. يعد هيكل البروتينات المغلفة للجسيمات الفيروسية المسببة للأمراض أمرا مهما لفهم أمراض العدوى الفيروسية ، وكذلك تطوير نظام التشخيص واللقاحات على سبيل المثال ، SARS-CoV-2 11 ، الذي تسبب في جائحةCOVID-19. علاوة على ذلك ، تم تطبيق تقنيات cryo-EM مؤخرا على علوم المواد ، مثل تصوير المواد الحساسة للشعاع المستخدمة في البطارية12،13،14 والأنظمة التحفيزية14،15 وتحليل بنية المواد غير العضوية في حالة الحل 16.
على الرغم من التطورات الملحوظة في cryo-EM والتقنيات ذات الصلة ، توجد قيود في إعداد عينات التبريد ، مما يعوق تحليل بنية 3D عالية الإنتاجية. يعد إعداد فيلم ثلج زجاجي بسماكة مثالية أمرا مهما بشكل خاص للحصول على بنية 3D للمواد البيولوجية بدقة ذرية. يجب أن يكون الجليد رقيقا بما يكفي لتقليل ضوضاء الخلفية من الإلكترونات المتناثرة بواسطة الجليد ولمنع تداخل الجزيئات الحيوية على طول مسار شعاع الإلكترون 1,17. ومع ذلك ، إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فقد يتسبب في محاذاة جزيئات البروتين في الاتجاهات المفضلة أو تشويه18،19،20. لذلك ، يجب تحسين سمك الجليد الزجاجي اعتمادا على حجم المادة ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى جهد مكثف لإعداد العينات والفحص اليدوي لسلامة الجليد والبروتين على شبكات TEM المعدة. هذه العملية تستغرق وقتا طويلا للغاية ، مما يعوق كفاءتها لتحليل هيكل 3D عالي الإنتاجية. ولذلك، فإن التحسينات في موثوقية وقابلية استنساخ إعداد عينات التبريد EM من شأنها أن تعزز استخدام cryo-EM في البيولوجيا الهيكلية واكتشاف الأدوية التجارية، وكذلك لعلوم المواد.
هنا ، نقدم عمليات التصنيع الدقيق لصنع شريحة ذات نقوش دقيقة مع نوافذ أكسيد الجرافين (GO) المصممة ل cryo-EM عالي الإنتاجية مع سمك الجليد المتحكم فيه21. تم تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة باستخدام تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS) ، والتي يمكنها التعامل مع بنية وأبعاد الشريحة اعتمادا على أغراض التصوير. تحتوي الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO على بنية microwell يمكن ملؤها بمحلول العينة ، ويمكن تنظيم عمق البئر الصغير للتحكم في سمك الجليد الزجاجي. يعزز التقارب القوي ل GO للجزيئات الحيوية تركيز الجزيئات الحيوية للتصور ، مما يحسن كفاءة تحليل الهيكل. علاوة على ذلك ، تتكون الشريحة ذات النقوش الدقيقة من إطار Si ، والذي يوفر استقرارا ميكانيكيا عاليا للشبكة19 ، مما يجعلها مثالية للتعامل مع الشريحة أثناء إجراءات إعداد العينات والتصوير بالتبريد EM. لذلك ، توفر الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO المصنعة بواسطة تقنيات MEMS الموثوقية والتكرار لإعداد عينات cryo-EM ، والتي يمكن أن تمكن من تحليل هيكل فعال وعالي الإنتاجية استنادا إلى cryo-EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>443778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Park Systems, South Korea</td>
			<td>NX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aligner</td>
			<td>Midas System, South Korea</td>
			<td>MDA-600S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials USA Corp., USA</td>
			<td>184411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM holder</td>
			<td>Gatan, USA</td>
			<td>626 single tilt cryo-EM holder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-plunging machine</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)</td>
			<td>FEI Company, USA</td>
			<td>Helios NanoLab 650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Ted Pella Inc., USA</td>
			<td>PELCO easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene oxide (GO) solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>763705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>10226590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)</td>
			<td>Centrotherm, Germany</td>
			<td>LPCVD E1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maP1205 positive PR</td>
			<td>Micro resist technology, Germany</td>
			<td>A15139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH), flake</td>
			<td>DAEJUNG CHEMICALS &#38; METALS Co. LTD., South Korea</td>
			<td>6597-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raman Spectrometer</td>
			<td>NOST, South Korea</td>
			<td>Confocal Micro Raman System HEDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive ion etcher (RIE)</td>
			<td>Scientific Engineering, South Korea</td>
			<td>Lab-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>SUPRA 55VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafer</td>
			<td>JP COMMERCE, South Korea</td>
			<td></td>
			<td>4&#34; Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Dong Ah Trade Corp., South Korea</td>
			<td>ACE-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy

أحد القيود الرئيسية على تحليل بنية الجزيئات الحيوية بكفاءة وإنتاجية عالية باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) هو صعوبة إعداد عينات cryo-EM بسماكة جليد خاضعة للرقابة على المستوى النانوي. تم تطوير الشريحة القائمة على السيليكون (Si) ، والتي تحتوي على مجموعة منتظمة من الثقوب الدقيقة مع نافذة أكسيد الجرافين (GO) المنقوشة على فيلم نيتريد السيليكون الذي يتم التحكم فيه بسماكة (SixNy) ، من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS). تم استخدام الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية ، وترسب البخار الكيميائي ، والنقش الرطب والجاف للفيلم الرقيق ، وصب الصفائح النانوية 2D للإنتاج الضخم للرقائق ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO. يتم تنظيم عمق الثقوب الدقيقة للتحكم في سمك الجليد عند الطلب ، اعتمادا على حجم العينة لتحليل cryo-EM. يركز التقارب الإيجابي ل GO تجاه الجزيئات الحيوية على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية داخل الثقب الصغير أثناء إعداد عينة cryo-EM. تتيح الشريحة ذات النقوش الدقيقة المزودة بنوافذ GO التصوير بالتبريد EM عالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات البيولوجية ، بالإضافة إلى المواد النانوية غير العضوية.

تم تصنيع رقاقة صغيرة مع نوافذ GO بواسطة تصنيع MEMS ونقل ورقة نانوية 2D GO. تم إنتاج رقائق الأنماط الدقيقة بكميات كبيرة ، مع إنتاج حوالي 500 رقاقة من رقاقة واحدة 4 في رقاقة (الشكل 1B والشكل 2A ، B). يمكن التلاعب بتصميمات الرقائق ذات النقوش الدقيقة باستخدام تصمي...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy

يتم تصنيع رقاقة صغيرة منقوشة تم تطويرها حديثا مع نوافذ أكسيد الجرافين من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق ، مما يتيح التصوير المجهري الإلكتروني المبرد الفعال وعالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات الحيوية والمواد النانوية.

تصنيع رقاقة ذات نقوش دقيقة بسماكة يتم التحكم فيها للفحص المجهري الإلكتروني المبرد عالي الإنتاجية

A major limitation for the efficient and high-throughput structure analysis of biomolecules using cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is the ...

هذا البروتوكول مهم لتنظيم سمك حجم الصورة على مقياس النانو لمراقبة البروتينات والمواد النانوية ذات الأحجام المختلفة بنجاح باستخدام cryo EM. تسمح تقنية تصنيع Mem بالإنتاج الضخم للرقاقة الدقيقة. كما أنه يتيح اختيار أعماق وتصاميم الآبار ذات الأنماط الصغيرة. اعتمادا على الأغراض التجريبية.يمكن أن تسهم هذه التقنية في تعزيز كفاءة تحليل بنية 3D عالي الإنتاجية للجزيئات الحيوية التي تستخدم لاكتشاف الأدوية التجارية ، ومن ثم يمكن أن تكون الرقائق الرقيقة والرقائق الدقيقة ذات أغشية السيليكون نيترو التي تميل إلى المخاطر صعبة. من المهم عدم ثني الرقاقة أو تطبيق قوى عمودية على نافذة نترات السيليكون. ابدأ في نمط مقاومة الصورة ، أو العلاقات العامة عن طريق تغطية رقاقة السيليكون المودعة بنتريد السيليكون بمحلول سداسي ميثيل ديسيلازان ثم قم بتدوير طلاء الرقاقة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية على مبرمج دوار.اخبز الرقاقة المطلية على درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية على صفيحة ساخنة لجعل سطح الماء كارها للماء وضمان أداء طلاء جيد مع العلاقات العامة. بعد ذلك ، قم بتدوير الرقاقة بعلاقات عامة إيجابية واخبزها 100 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. يبلغ سمك العلاقات العامة المطلية بالدوران 500 نانومتر. قم بتعريض الرقاقة المطلية بالعلاقات العامة للأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس ثوان من خلال قناع الكروم باستخدام مصفف.قم بتطوير العلاقات العامة لمدة دقيقة واحدة باستخدام مطور وشطفها مرتين عن طريق غمر الرقاقة في الماء منزوع الأيونات. ثم جفف الرقاقة المنقوشة PR عن طريق نفخ غاز النيتروجين على سطح الماء. بعد نمط العلاقات العامة. استخدم محفورا أيونيا تفاعليا مبنيا في المختبر بقوة تردد لاسلكي تبلغ 50 واط ، ومع غاز سادس فلوريد الكبريت عند ثلاثة سنتيمترات مكعبة قياسية في الدقيقة.لحفر نيتريد السيليكون المكشوف بمعدل ستة أنغستروم في الثانية. تخلص من العلاقات العامة عن طريق غمر رقاقة نيتريد السيليكون المنقوشة في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يليه شطف الرقاقة مرتين في الماء منزوع الأيونات وتجفيف الرقاقة بغاز النيتروجين.لحفر السي المكشوف ، اغمر رقاقة نيتريد السيليكون المنقوشة في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم المحضر حديثا. مع التحريك المستمر حتى يمكن ملاحظة نوافذ نيتريد السيليكون القائمة بذاتها على الجانب الآخر من الرقاقة المنقوشة. نظف الرقاقة المحفورة عن طريق غمسها عدة مرات في حمام مائي منزوع الأيونات.ثم جفف الرقاقة في الهواء. للقضاء على بقايا الحفر ، اضغط برفق على حدود صفيف الرقائق باستخدام ملاقط واحصل على مجموعة من الرقائق لتكون منقوشة بشكل دقيق. ثم اغمر مجموعة الرقائق في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم المحضر حديثا لمدة 30 ثانية ، يليه الشطف مرتين ، ونفخ الرقائق بغاز النيتروجين وتجفيفها في الهواء لمدة ساعة واحدة.للحصول على دعم صلب ، قم بإعداد رقاقة سيليكون فارغة بسعة 525 ميكرومتر مع طلاء الدوران كما هو موضح سابقا. تعلق على شعاع التقطيع على رقاقة السيليكون قبل خبز رقاقة واتبع الإجراء كما هو موضح سابقا للحصول على رقاقة السيليكون micropattern. تخلص من العلاقات العامة عن طريق غمر شريحة النمط المحددة في محلول واحد من الميثيل اثنين من الليتانول النقي عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، اشطف مجموعة الشرائح مرتين بالماء منزوع الأيونات. بعد تجفيف مجموعة شرائح النمط بالنيتروجين ، قم بإزالة بقايا العلاقات العامة باستخدام عملية بلازما الأكسجين باستخدام 100 سنتيمتر مكعب قياسي في الدقيقة من غاز الأكسجين بقوة تردد لاسلكي تبلغ 150 واط لمدة دقيقة واحدة باستخدام حفر الأيون التفاعلي. في وقت لاحق ، اغمر الرقائق الصغيرة المنقوشة في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم لمدة 30 ثانية للقضاء تماما على بقايا العلاقات العامة.ثم شطف وتجفيف مجموعة رقاقة تماما. تمييع اثنين ملليغرام لكل ملليلتر أكسيد الجرافين أو محلول 10 أضعاف مع الماء منزوع الأيونات وسونيك المحلول المخفف لمدة 10 دقائق لتفتيت الركام من الأوراق. ثم الطرد المركزي إلى المحلول المخفف في 300 مرة G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.استخدم مفرغ توهج عند 15 مليون أمبير لتفريغ توهج الجانب المحفور من السيليكون من شريحة النمط الصغير لمدة دقيقة واحدة وجعل سطح الشريحة بشحنة موجبة. عند الانتهاء ، قم بإسقاط ثلاثة ميكرولترات من المحلول على جانب تفريغ التوهج من رقاقة micropattern. بعد دقيقة واحدة ، لطخ المحلول الزائد على الشريحة بورق التصفية.اغسل الشريحة المنقولة بقطرات ماء منزوعة الأيونات على فيلم بارافين وامسح الفائض بورق الترشيح. كرر إجراء صب الإسقاط مرتين على الجانب المنقول ومرة واحدة على الجانب الآخر. جفف الشريحة المنقولة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.أثناء إجراء الطباعة الحجرية الضوئية ، تم التلاعب بتصميمات رقائق النمط الدقيق باستخدام تصميمات مختلفة لقناع الكروم. تم التحكم في أعداد وأبعاد أغشية نيتريد السيليكون القائمة بذاتها. لوحظ أن الرقائق الصغيرة المنقوشة يمكن أن تحتوي على ما يصل إلى 25000 ثقب معلق.عرض طيف الرامن في النافذة القمم التمثيلية لل بالإضافة إلى ذلك ، أشارت أنماط الانكسار السداسي الموجهة نحو الضرب إلى أن النوافذ تتكون من طبقات متعددة تمت دراسة بنية وعمق الثقب الصغير مع النوافذ باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ومجهر القوة الذرية. لوحظ وجود هيكل من نوع البئر للثقب الصغير مع النافذة في الصور يؤكد إمكانية تصميم رقاقة النمط الصغير مع النوافذ. بمساعدة الشريحة المتناهية الصغر ، تم تصوير بعض العينات البيولوجية والجسيمات النانوية غير العضوية باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد.من المهم تحسين الظروف مثل سمك الطلاء النقي باستخدام الكثافة وتطوير الوقت للنقوش الدقيقة اعتمادا على حجم وتصميم الأنماط. من خلال تطبيق تقنيات الارتطام النانوي مثل FIB أو حتى الجرافين الليثو أصغر يمكن إنتاج بعض أنماط الميكرومتر التي قد توسع تطبيقات هذا الجهاز الصغير حيث يتم استخدامه مع تقنيات تحليلية أخرى.

Research

JoVE Journal

Engineering

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

تلفيق بوابة الانضباطي الجرافين أجهزة لمسح حفر نفق المجهر الدراسات مع كولوم الشوائب

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Preparation of Liquid-exfoliated Transition Metal Dichalcogenide Nanosheets with Controlled Size and Thickness: A State of the Art Protocol

إعداد تقشر السائل الانتقال المعادن Dichalcogenide Nanosheets مع تسيطر الحجم والسماكة: دولة على البروتوكول الفن

We summarize recent advances in the production of liquid-exfoliated transition metal dichalcogenide (TMD) nanosheets with controlled size and thickness. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

دراسة العمليات الديناميكية للأجسام نانو الحجم في السائل باستخدام المسح الضوئي نقل المجهر

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

أسلوب للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات المجهرية في مجهر إلكتروني

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

حقن الإلكترون المحسنة وحبس أكسيتون للصمامات الثنائية – ينبعث الضوء الكم-نقطة زرقاء نقية بإدخال الكاثود الألومنيوم المؤكسد جزئيا

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون نانومتر ذات الأرقام المفردة مع مجهر إلكتروني انتقال المسح ضوئي لتصحيح الانحراف

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

High Throughput Analysis of Liquid Droplet Impacts

تحليل الإنتاجية العالية لتأثيرات قطرات السائل

Experimental studies of liquid drop impacts on surfaces are often restricted in their scope due to the large range of possible experimental parameters ...

Fabrication and Characterization of Thickness Mode Piezoelectric Devices for Atomization and Acoustofluidics

تصنيع وتوصيف من سماكة وضع الأجهزة الكهروضوئية للانحلال وAcoustofluidics

We present a technique to fabricate simple thickness mode piezoelectric devices using lithium niobate (LN). Such devices have been shown to atomize liquid ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

في الموقع الإرسال المجهري الإلكتروني مع التحيز وتصنيع العارضة غير المتماثلة على أساس مختلط على مراحل A-VOx

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Cryogenic Liquid Jets for High Repetition Rate Discovery Science

نفاثات سائلة مبردة لعلم اكتشاف معدل تكرار مرتفع

This protocol presents a detailed procedure for the operation of continuous, micron-sized cryogenic cylindrical and planar liquid jets. When operated as ...