Name: fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-04-21T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

M.-H.K., S.K., M.L., ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של המכון למדע בסיסי (מענק מס' IBS-R006-D1). S.K., M.L., ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של תוכנית החוקרים החלוצים היצירתיים דרך האוניברסיטה הלאומית של סיאול (2021) ומענק ה- NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; גרנט מס' NRF-2020R1A2C2101871, ו- NRF-2021M3A9I4022936). M.L. ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של מלגת POSCO Science של קרן POSCO TJ Park ומענק NRF הממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס' NRF-2017R1A5A1015365). J.P. מכיר בתמיכה הכספית ממענק ה-NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס' NRF-2020R1A6C101A183), ותוכניות יוזמות המחקר הבין-תחומיות של המכללה להנדסה והמכללה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית של סיאול (2021). M.-H.K. מכיר בתמיכה הכספית ממענק ה-NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס' NRF-2020R1I1A1A0107416612). המחברים מודים לצוות ולצוות של המרכז האוניברסיטאי הלאומי בסיאול להדמיית מקרומולקולרית ותא (SNU CMCI) על מאמציהם הבלתי נלאים וההתמדה שלהם בניסויי cryo-EM. המחברים מודים לס.ג'יי קים מהמרכז הלאומי למתקני מחקר בין-אוניברסיטאיים על הסיוע בניסויי FIB-SEM.

1. ייצור שבב עם מיקרו-דפוס עם חלונות GO (איור 1)
<ol><li>להפקיד את הסיליקון ניטריד.<ol><li>הפקדת סיליקון ניטריד במתח נמוך (SixNy) משני צידי פרוסת Si (קוטר 4 אינץ ' ועובי של 100 מיקרומטר) באמצעות תצהיר אדים כימי בלחץ נמוך (LPCVD) בטמפרטורה של 830 °C ולחץ של 150 mTorr, תחת ז...

<ol>
	<li>Dillard, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+at+the+cutting+edge+of+cryo-electron+microscopy.">Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+improve+protein+distribution+on+holey+carbon+cryo-EM+supports.">Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Xu, B. J., Developments Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications,+and+prospects+of+cryo-electron+microscopy.">applications, and prospects of cryo-electron microscopy.</a> Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>Darrow, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chameleon:+next+generation+sample+preparation+for+cryoEM+based+on+spotiton.">Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton.</a> Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).</li><li>Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+gating+the+high-conductance+Ca2+-activated+K++channel.">Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel.</a> Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+activated+GLP-1+receptor+in+complex+with+a+G+protein.">Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein.</a> Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).</li><li>Shaik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+coreceptor+recognition+by+HIV-1+envelope+spike.">Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike.</a> Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+inactivated+SARS-CoV-2+with+postfusion+spikes+revealed+by+cryo-EM+and+cryo-ET.">The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET.</a> Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).</li><li>Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+energy+materials+by+cryogenic+electron+microscopy.">Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy.</a> Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).</li><li>Li, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+sensitive+battery+materials+and+Interfaces+revealed+by+cryo-electron+microscopy.">Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy.</a> Science. 358 (6362), 506-510 (2017).</li><li>Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience.">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+synthesis+of+palladium+species+confined+in+a+small-pore+zeolite+via+full+ion-exchange+investigated+by+cryogenic+electron+microscopy.">Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).</li><li>Baumgartner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+growth+of+magnetite+from+solution.">Nucleation and growth of magnetite from solution.</a> Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).</li><li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids.">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Kang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide-supported+microwell+grids+for+preparing+cryo-EM+samples+with+controlled+ice+thickness.">Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).</li><li>Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+safe+graphene+preparation+on+solution+based+platform.">Facile and safe graphene preparation on solution based platform.</a> Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).</li><li>Yang, C., Pham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+study+of+silicon+nitride+films+deposited+by+LPCVD+and+PECVD.">Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD.</a> Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).</li><li>Olson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+LPCVD+process+conditions+for+the+deposition+of+low+stress+silicon+nitride.+Part+I:+preliminary+LPCVD+experiments.">Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments.</a> Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).</li><li>Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+low+stress+silicon+nitride+thin+film+and+its+application+in+surface+micromachining+device+structures.">Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures.</a> Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).</li><li>Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrostatic+actuator+for+fatigue+testing+of+low-stress+LPCVD+silicon+nitride+thin+films.">An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).</li><li>Shafikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+ultrathin+Si3N4+membranes+by+compressive+surface+stress.">Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).</li><li>Ng, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+and+modelling+the+wetting+properties+of+III-V+semiconductor+surfaces+using+re-entrant+nanostructures.">Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures.</a> Scientific Reports. 8, 3544 (2018).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-templated+silver+nanoparticle+arrays+photopolymerized+in+zero-mode+waveguides.">Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides.</a> Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).</li><li>Escobedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+nanohole+array+based+sensing:+a+review.">On-chip nanohole array based sensing: a review.</a> Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).</li></ol>

תהליכי המיקרו-פבריקציה לייצור שבבים עם מיקרו-תבניות עם חלונות GO מוצגים כאן. השבב המיקרו-תבניתי המפוברק נועד לווסת את עובי שכבת הקרח הזגוגית על ידי שליטה בעומק המיקרו-חור באמצעות חלונות GO בהתאם לגודל החומר שיש לנתח. שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות GO יוצר באמצעות סדרה של טכניקות MEMS ושיטת העברת...

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) פותחה כדי לפתור את המבנה התלת-ממדי (התלת-ממדי) של חלבונים במצבם הטבעי 1,2,3,4. הטכניקה כוללת קיבוע חלבונים בשכבה דקה (10-100 ננומטר) של קרח זגוגי ורכישת תמונות הקרנה של חלבונים בעלי אוריינטציה אקראית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), כאשר הדגימה נשמרת בטמפרטורת חנקן נוזלי. אלפי עד מיליוני תמונות הקרנה נרכשות ומשמשות לשחזור מבנה תלת-ממדי של החלבון על ידי אלגוריתמים חישוביים 5,6. לצורך ניתוח מוצלח עם cryo-EM, הכנת דגימת cryo הפכה לאוטומטית על ידי הקפאת הציוד השולט בתנאי הכתם, הלחות והטמפרטורה. תמיסת הדגימה מועמסת על רשת TEM עם ממברנת פחמן חורית, מוכתמת ברצף כדי להסיר את התמיסה העודפת, ולאחר מכן צוללת-קפואה עם אתאן נוזלי כדי לייצר קרח דק וזגוגי 1,5,6. עם ההתקדמות ב- cryo-EM והאוטומציה של הכנת דגימה7, cryo-EM שימש יותר ויותר לפתרון מבנה החלבונים, כולל חלבוני מעטפת עבור וירוסים וחלבוני תעלת יונים בקרום התא 8,9,10. המבנה של חלבוני מעטפת של חלקיקים נגיפיים פתוגניים חשוב להבנת הפתולוגיה של זיהומים נגיפיים, כמו גם לפיתוח מערכת האבחון והחיסונים, למשל SARS-CoV-211, שגרמו למגפת COVID-19. יתר על כן, טכניקות cryo-EM יושמו לאחרונה במדעי החומרים, כגון עבור הדמיה של חומרים רגישים לאלומה המשמשים בסוללה 12,13,14 ובמערכותקטליטיות 14,15 וניתוח המבנה של חומרים אנאורגניים במצב פתרון16.
למרות התפתחויות בולטות ב- cryo-EM ובטכניקות רלוונטיות, קיימות מגבלות בהכנת דגימת cryo, מה שמפריע לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. הכנת סרט קרח זגוגי בעובי אופטימלי חשובה במיוחד לקבלת המבנה התלת-ממדי של חומרים ביולוגיים ברזולוציה אטומית. הקרח חייב להיות דק מספיק כדי למזער את רעשי הרקע מאלקטרונים המפוזרים על ידי הקרח ולאסור על חפיפה של ביו-מולקולות לאורך נתיב קרן האלקטרונים 1,17. עם זאת, אם הקרח דק מדי, הוא עלול לגרום למולקולות חלבון להתיישר בכיוונים מועדפים או לנטרל 18,19,20. לכן, עובי הקרח הזגוגי צריך להיות מותאם בהתאם לגודל החומר המעניין. יתר על כן, בדרך כלל נדרש מאמץ נרחב להכנת דגימה ולסינון ידני של שלמות הקרח והחלבון ברשתות ה-TEM המוכנות. תהליך זה גוזל זמן רב, מה שמעכב את יעילותו לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. לכן, שיפורים באמינות ובשכפול של הכנת דגימות cryo-EM ישפרו את השימוש ב- cryo-EM בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות מסחריות, כמו גם במדע החומרים.
כאן, אנו מציגים תהליכי מיקרו-פבריקציה ליצירת שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות תחמוצת גרפן (GO) המיועדים לקריו-EM בתפוקה גבוהה עם עובי קרח מבוקר21. השבב בעל התבנית הזעירה יוצר באמצעות טכניקות של מערכת מיקרו-אלקטרומכנית (MEMS), שיכולה לתמרן את המבנה והממדים של השבב בהתאם למטרות ההדמיה. לשבב המיקרו-תבניתי עם חלונות GO יש מבנה מיקרווול שניתן למלא בתמיסת הדגימה, וניתן לווסת את עומק המיקרווול כדי לשלוט בעובי הקרח הזגוגי. הזיקה החזקה של GO לביומולקולות מגבירה את ריכוז הביומולקולות להדמיה, ומשפרת את היעילות של ניתוח המבנה. יתר על כן, השבב בעל התבנית הזעירה מורכב ממסגרת Si, המספקת יציבות מכנית גבוהה עבור הרשת19, מה שהופך אותה לאידיאלית לטיפול בשבב במהלך הליכי הכנת דגימה והדמיית cryo-EM. לכן, שבב מיקרו-תבניתי עם חלונות GO המיוצרים על ידי טכניקות MEMS מספק אמינות ושכפול של הכנת דגימת cryo-EM, אשר יכול לאפשר ניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה המבוסס על cryo-EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>443778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Park Systems, South Korea</td>
			<td>NX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aligner</td>
			<td>Midas System, South Korea</td>
			<td>MDA-600S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials USA Corp., USA</td>
			<td>184411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM holder</td>
			<td>Gatan, USA</td>
			<td>626 single tilt cryo-EM holder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-plunging machine</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)</td>
			<td>FEI Company, USA</td>
			<td>Helios NanoLab 650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Ted Pella Inc., USA</td>
			<td>PELCO easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene oxide (GO) solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>763705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>10226590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)</td>
			<td>Centrotherm, Germany</td>
			<td>LPCVD E1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maP1205 positive PR</td>
			<td>Micro resist technology, Germany</td>
			<td>A15139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH), flake</td>
			<td>DAEJUNG CHEMICALS &#38; METALS Co. LTD., South Korea</td>
			<td>6597-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raman Spectrometer</td>
			<td>NOST, South Korea</td>
			<td>Confocal Micro Raman System HEDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive ion etcher (RIE)</td>
			<td>Scientific Engineering, South Korea</td>
			<td>Lab-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>SUPRA 55VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafer</td>
			<td>JP COMMERCE, South Korea</td>
			<td></td>
			<td>4&#34; Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Dong Ah Trade Corp., South Korea</td>
			<td>ACE-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy

מגבלה מרכזית לניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) היא הקושי להכין דגימות cryo-EM עם עובי קרח מבוקר בקנה מידה ננומטרי. השבב מבוסס הסיליקון (Si), בעל מערך קבוע של מיקרו-חורים עם חלון תחמוצת גרפן (GO) המעוצב על סרט סיליקון ניטריד מבוקר עובי (Six Ny), פותח על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית (MEMS). פוטוליתוגרפיה של UV, תצהיר אדים כימיים, תחריט רטוב ויבש של הסרט הדק, ויציקת טיפות של חומרי ננו-יריעה דו-ממדיים שימשו לייצור המוני של השבבים בעלי התבניות הזעירות עם חלונות GO. עומק החורים הזעירים מווסת כדי לשלוט בעובי הקרח לפי דרישה, בהתאם לגודל הדגימה לצורך ניתוח cryo-EM. הזיקה החיובית של GO לביו-מולקולות מרכזת את הביומולקולות המעניינות בתוך החור המיקרו במהלך הכנת דגימת cryo-EM. השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO מאפשר הדמיית cryo-EM בתפוקה גבוהה של מולקולות ביולוגיות שונות, כמו גם ננו-חומרים אנאורגניים.

שבב בדוגמת מיקרו עם חלונות GO יוצר על ידי ייצור MEMS והעברת ננו-יריעות GO דו-ממדיות. שבבים למיקרו-דפוסים יוצרו בייצור המוני, עם כ-500 שבבים שהופקו מתוך פרוסה אחת של 4 אינץ' (איור 1B ואיור 2A,B). ניתן לתפעל את העיצובים של השבבים בעלי התבניות הזעירות באמצעות עיצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy

שבב מיקרו-תבניתי שפותח לאחרונה עם חלונות תחמוצת גרפן מיוצר על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית, המאפשרות הדמיה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה של ביומולקולות וננו-חומרים שונים.

ייצור שבב מיקרו-תבניתי בעובי מבוקר למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה

A major limitation for the efficient and high-throughput structure analysis of biomolecules using cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is the ...

פרוטוקול זה חשוב לוויסות עובי גודל התמונה בקנה מידה ננומטרי כדי לצפות בהצלחה בחלבונים ובחומרים ננומטריים בגדלים שונים באמצעות cryo EM. טכניקת הייצור של המם מאפשרת ייצור המוני של השבב. זה גם מאפשר בחירה של עומקים ועיצובים של בארות דפוס מיקרו. בהתאם למטרות הניסוי.הטכניקה יכולה לתרום להגברת היעילות של ניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה של ביומולקולות המשמשות לגילוי תרופות מסחריות, ואז פרוסות דקות ושבבים עם ממברנות ניטרו סיליקון נוטות סיכון יכולות להיות מסובכות. חשוב לא לכופף את הוופל או להפעיל כוחות בניצב לחלון הסיליקון החנקתי. התחל לעצב את התנגדות הצילום, או יחסי ציבור על ידי כיסוי פרוסת סיליקון ניטריד שהופקדה בסיליקון עם תמיסת הקסמתיל-דיסילאזאן ולאחר מכן סובב את הציפוי של הוופל במהירות של 3000 סל"ד למשך 30 שניות על מקודד ספין.אופים את הוופל המצופה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות על פלטה חמה כדי להפוך את פני המים להידרופוביים ולהבטיח ביצועי ציפוי טובים עם יחסי הציבור. לאחר מכן, לסובב את הוופל עם יחסי ציבור חיוביים ואופים אותו 100 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות. ליחסי ציבור מצופים ספין יש עובי של 500 ננומטר. חשוף את הוופל המצופה PR לאור אולטרה סגול למשך חמש שניות דרך מסכת כרום באמצעות קשתית.פתחו את יחסי הציבור למשך דקה אחת באמצעות מפתח ושטפו פעמיים על ידי טבילת הוופל במים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן ייבשו את הוופל בדוגמת יחסי ציבור על ידי ניפוח גז חנקן על פני המים. בעקבות התבנית של יחסי הציבור. השתמש בתחריט יונים תגובתי שנבנה במעבדה בהספק תדר רדיו של 50 וואט, ועם גז הקספלואוריד גופרית בשלושה סנטימטרים מעוקבים סטנדרטיים לדקה.כדי לחרוט את הסיליקון ניטריד החשוף בקצב של שישה אנגסטרום לשנייה. בטלו את יחסי הציבור על ידי טבילת הוופל בדוגמת סיליקון ניטריד באצטון בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן שטיפת הוופל פעמיים במים שעברו דה-יוניזציה וייבוש הוופל בגז חנקן.כדי לחרוט את הסי החשוף, טבלו את הוופל בדוגמת סיליקון ניטריד בתמיסת אשלגן הידרוקסיד שהוכנה זה עתה. עם ערבוב מתמשך עד חלונות הסיליקון nitride העומדים בפני עצמם ניתן לראות בצד הנגדי של רקיק מעוצב. נקו את הוופל החרוט על ידי טבילתו מספר פעמים באמבט מים שעבר דה-יוניזציה.ואז לייבש את רקיק באוויר. כדי לחסל את שאריות התחריט, לחץ קלות על גבולות מערך השבבים עם פינצטה וקבל מערך של שבבים להיות בדוגמת מיקרו. לאחר מכן לטבול את מערך השבבים בתמיסת אשלגן הידרוקסיד טרייה שהוכנה במשך 30 שניות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים, לנשוף את השבבים עם גז חנקן ולייבש אותם באוויר במשך שעה אחת.לתמיכה מוצקה הכינו פרוסת סיליקון ריקה בגודל 525 מיקרומטר עם ציפוי הספין כפי שהודגם קודם לכן. מחובר לקרן הצ'יפר על פרוסת הסיליקון לפני אפיית הוופל ופעל לפי ההליך כפי שתואר קודם לכן כדי לקבל את פרוסת הסיליקון המיקרו-פיגורנית. בטל את יחסי הציבור על ידי טבילת שבב התבנית שנקבע בתמיסת מתיל שני ליטנול טהורה אחת ב-60 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.למחרת, לשטוף את השבב להגדיר פעמיים עם מים deionized. לאחר ייבוש שבב התבנית עם חנקן, לחסל את שאריות יחסי הציבור עם תהליך פלזמה חמצן באמצעות 100 סנטימטרים מעוקבים סטנדרטיים לדקה של גז חמצן בהספק תדר רדיו של 150 וואט למשך דקה אחת עם היון הריאקטיבי. מאוחר יותר, טבלו את השבבים בדוגמת מיקרו בתמיסת אשלגן הידרוקסיד למשך 30 שניות כדי לחסל לחלוטין את שאריות יחסי הציבור.לאחר מכן לשטוף ולייבש לחלוטין את ערכת השבבים. לדלל שני מיליגרם לכל מיליליטר תחמוצת גרפן או תמיסה 10 פעמים עם מים deionized ו sonicate את הפתרון מדולל במשך 10 דקות כדי לשבור אגרגטים של יריעות. לאחר מכן צנטריפוגה לתמיסה המדוללת ב-300 פעמים G למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.השתמש בפריקה זוהרת ב-15 מיליון אמפר כדי להאיר את הצד החרוט בסיליקון של שבב תבנית המיקרו למשך דקה אחת ולעבד את פני השטח של השבב עם מטען חיובי. בסיום, השליכו שלושה מיקרוליטרים של התמיסה על צד פריקה זוהרת של שבב המיקרופייטר. לאחר דקה אחת, כתם הפתרון העודף על השבב עם נייר סינון.לשטוף את השבב המועבר עם טיפות מים deionized על סרט פרפין וכתם את עודף עם נייר סינון. חזור על הליך יציקת הטיפה פעמיים בצד המועבר ופעם אחת בצד הנגדי. יבשו את השבב המועבר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.במהלך הליך הפוטוליתוגרפיה העיצובים של שבבי תבנית המיקרו עברו מניפולציה באמצעות עיצובים שונים של מסכת הכרום. המספרים והממדים של קרומי הסיליקון ניטריד העומדים בפני עצמם נשלטו. זה היה ציין כי שבבים בדוגמת מיקרו מפוברק יכול להיות עד 25, 000 חורים תלויים.ספקטרום הראמן בחלון הציג את הפסגות המייצגות של ה- בנוסף, תבניות השבירה המשושה המוכוונות המוכפלות הצביעו על כך שהחלונות מורכבים מהרב-שכבתי המבנה והעומק של חור המיקרו עם החלונות נחקרו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת ומיקרוסקופיית כוח אטומי. מבנה סוג היטב של חור מיקרו עם החלון נצפתה בתמונות המאשרות את האפשרות של העיצוב של שבב דפוס מיקרו עם חלונות. בעזרת השבב בדוגמת המיקרו, כמה דגימות ביולוגיות וננו-חלקיקים אנאורגניים צולמו באמצעות מיקרוסקופ האלקטרונים קריו.חשוב לייעל את התנאים כגון עובי ציפוי טהור תוך שימוש בעוצמה ופיתוח זמן לתבניות מיקרו בהתאם לגודל ולעיצוב הדוגמאות. על ידי יישום טכניקות טפיחה ננו כגון FIB או אפילו גרפן ליתו קטן יותר ניתן לייצר כמה תבניות מיקרומטר אשר עשויות להרחיב את היישומים של התקן מיקרו זה שבו הוא משמש עם טכניקות אנליטיות אחרות.

Research

JoVE Journal

Engineering

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

המצאה של השער-מתכונן התקני גראפן לסריקה מיקרוסקופית מנהור מחקרים עם זיהומים קולון

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Preparation of Liquid-exfoliated Transition Metal Dichalcogenide Nanosheets with Controlled Size and Thickness: A State of the Art Protocol

הכנת Nanosheets Dichalcogenide מתכות מעבר נוזלי-מודבק עם גודל מבוקרת עובי: מדינה לפרוטוקול אמנות

We summarize recent advances in the production of liquid-exfoliated transition metal dichalcogenide (TMD) nanosheets with controlled size and thickness. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

לימוד תהליכים דינמיים של אובייקטים בגודל ננו בנוזל באמצעות מיקרוסקופי אלקטרוני סריקת הילוכים

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

הזרקה משופרת אלקטרון וכליאתם אקסיטון עבור טהור קוונטית-נקודה כחולה דיודות פולטות אור על ידי החדרת חלקית תחמוצת אלומיניום קטודה

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

חד-ספרתיות ננומטר ליתוגרפיה קרינה עם תיקון סטייה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרוני

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

High Throughput Analysis of Liquid Droplet Impacts

ניתוח תפוקה גבוהה של השפעות של Droplet נוזלי

Experimental studies of liquid drop impacts on surfaces are often restricted in their scope due to the large range of possible experimental parameters ...

Fabrication and Characterization of Thickness Mode Piezoelectric Devices for Atomization and Acoustofluidics

ייצור ואפיון של מכשירי פיזואלקטריים במצב עובי לאטוביזציה

We present a technique to fabricate simple thickness mode piezoelectric devices using lithium niobate (LN). Such devices have been shown to atomize liquid ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

ב מיקרוסקופ אלקטרונים שידור Situ עם הטיה והפיקה של מוטות אסימטריים המבוססים על מעורב שלבים a-VOx

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Cryogenic Liquid Jets for High Repetition Rate Discovery Science

סילונים נוזליים קריוגניים לגילוי קצב חזרות גבוה

This protocol presents a detailed procedure for the operation of continuous, micron-sized cryogenic cylindrical and planar liquid jets. When operated as ...