Name: fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-04-21T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

M.-H.K., S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Института фундаментальных наук (грант No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Creative-Pioneering Researchers Program через Сеульский национальный университет (2021) и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Грант Nos. NRF-2020R1A2C2101871 и NRF-2021M3A9I4022936). M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2017R1A5A1015365). J.P. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта NRF-2020R1A6C101A183) и междисциплинарные исследовательские инициативные программы Инженерного колледжа и Медицинского колледжа Сеульского национального университета (2021). M.-H.K. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2020R1I1A1A0107416612). Авторы благодарят сотрудников и экипаж Центра макромолекулярной и клеточной визуализации Сеульского национального университета (SNU CMCI) за их неустанные усилия и настойчивость в крио-ЭМ-экспериментах. Авторы благодарят S. J. Kim из Национального центра межуниверситетских исследовательских учреждений за помощь в экспериментах FIB-SEM.

1. Изготовление микроструктурированного чипа с окнами GO (рисунок 1)
<ol><li>Нанесите нитрид кремния.<ol><li>Нанесите низконапряженный нитрид кремния (SixNy) на обе стороны кремниевой пластины (диаметр 4 дюйма и толщина 100 мкм) с использованием химиче?...

<ol>
	<li>Dillard, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+at+the+cutting+edge+of+cryo-electron+microscopy.">Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+improve+protein+distribution+on+holey+carbon+cryo-EM+supports.">Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Xu, B. J., Developments Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications,+and+prospects+of+cryo-electron+microscopy.">applications, and prospects of cryo-electron microscopy.</a> Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>Darrow, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chameleon:+next+generation+sample+preparation+for+cryoEM+based+on+spotiton.">Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton.</a> Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).</li><li>Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+gating+the+high-conductance+Ca2+-activated+K++channel.">Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel.</a> Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+activated+GLP-1+receptor+in+complex+with+a+G+protein.">Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein.</a> Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).</li><li>Shaik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+coreceptor+recognition+by+HIV-1+envelope+spike.">Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike.</a> Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+inactivated+SARS-CoV-2+with+postfusion+spikes+revealed+by+cryo-EM+and+cryo-ET.">The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET.</a> Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).</li><li>Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+energy+materials+by+cryogenic+electron+microscopy.">Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy.</a> Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).</li><li>Li, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+sensitive+battery+materials+and+Interfaces+revealed+by+cryo-electron+microscopy.">Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy.</a> Science. 358 (6362), 506-510 (2017).</li><li>Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience.">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+synthesis+of+palladium+species+confined+in+a+small-pore+zeolite+via+full+ion-exchange+investigated+by+cryogenic+electron+microscopy.">Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).</li><li>Baumgartner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+growth+of+magnetite+from+solution.">Nucleation and growth of magnetite from solution.</a> Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).</li><li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids.">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Kang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide-supported+microwell+grids+for+preparing+cryo-EM+samples+with+controlled+ice+thickness.">Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).</li><li>Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+safe+graphene+preparation+on+solution+based+platform.">Facile and safe graphene preparation on solution based platform.</a> Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).</li><li>Yang, C., Pham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+study+of+silicon+nitride+films+deposited+by+LPCVD+and+PECVD.">Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD.</a> Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).</li><li>Olson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+LPCVD+process+conditions+for+the+deposition+of+low+stress+silicon+nitride.+Part+I:+preliminary+LPCVD+experiments.">Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments.</a> Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).</li><li>Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+low+stress+silicon+nitride+thin+film+and+its+application+in+surface+micromachining+device+structures.">Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures.</a> Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).</li><li>Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrostatic+actuator+for+fatigue+testing+of+low-stress+LPCVD+silicon+nitride+thin+films.">An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).</li><li>Shafikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+ultrathin+Si3N4+membranes+by+compressive+surface+stress.">Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).</li><li>Ng, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+and+modelling+the+wetting+properties+of+III-V+semiconductor+surfaces+using+re-entrant+nanostructures.">Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures.</a> Scientific Reports. 8, 3544 (2018).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-templated+silver+nanoparticle+arrays+photopolymerized+in+zero-mode+waveguides.">Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides.</a> Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).</li><li>Escobedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+nanohole+array+based+sensing:+a+review.">On-chip nanohole array based sensing: a review.</a> Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).</li></ol>

Здесь представлены процессы микрофабрикации для производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Изготовленный микроструктурированный чип предназначен для регулирования толщины стекловидного слоя льда путем контроля глубины микроотверстия с помощью окон GO в зависимости от р?...

Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) была разработана для разрешения трехмерной (3D) структуры белков в их родном состоянии 1,2,3,4. Метод включает фиксацию белков в тонком слое (10-100 нм) стекловидного льда и получение проекционных изображений случайно ориентированных белков с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ), при этом образец поддерживается при температуре жидкого азота. Тысячи и миллионы проекционных изображений получены и использованы для реконструкции 3D-структуры белка с помощью вычислительных алгоритмов 5,6. Для успешного анализа с помощью крио-ЭМ криоподготовка образцов была автоматизирована путем погружной заморозки оборудования, которое контролирует условия блоттинга, влажность и температуру. Образец раствора загружают на сетку ТЭМ с дырявой углеродной мембраной, последовательно промокают для удаления избытка раствора, а затем погружают-замораживают жидким этаном для получения тонкого стекловидного льда 1,5,6. С достижениями в области крио-ЭМ и автоматизации пробоподготовки7 крио-ЭМ все чаще используется для решения структуры белков, включая белки оболочки для вирусов и белки ионных каналов в клеточной мембране 8,9,10. Структура белков оболочки патогенных вирусных частиц важна для понимания патологии вирусной инфекции, а также разработки системы диагностики и вакцин, например, SARS-CoV-211, вызвавшего пандемию COVID-19. Кроме того, крио-ЭМ методы недавно были применены в материаловедении, например, для визуализации чувствительных к пучку материалов, используемых в батареях 12,13,14 и каталитических системах 14,15, и анализа структуры неорганических материалов в состоянии раствора16.
Несмотря на заметные изменения в крио-ЭМ и соответствующих методах, существуют ограничения в крио-пробоподготовке, препятствующие высокопроизводительному 3D-анализу структуры. Получение стекловидной ледяной пленки с оптимальной толщиной особенно важно для получения 3D-структуры биологических материалов с атомным разрешением. Лед должен быть достаточно тонким, чтобы минимизировать фоновый шум от электронов, рассеянных льдом, и запретить перекрытие биомолекул вдоль траектории электронного пучка 1,17. Однако, если лед слишком тонкий, это может привести к тому, что белковые молекулы выровняются в предпочтительных ориентациях или денатурируют 18,19,20. Поэтому толщина стекловидного льда должна быть оптимизирована в зависимости от размера интересующего материала. Кроме того, обычно требуются значительные усилия для подготовки образцов и ручного скрининга целостности льда и белка на подготовленных сетках ТЕА. Этот процесс чрезвычайно трудоемкий, что снижает его эффективность для высокопроизводительного анализа 3D-структур. Таким образом, повышение надежности и воспроизводимости крио-ЭМ пробоподготовки улучшит использование крио-ЭМ в структурной биологии и коммерческом открытии лекарств, а также в материаловедении.
Здесь мы вводим процессы микрофабрикации для изготовления микроструктурированного чипа с окнами оксида графена (GO), предназначенного для высокопроизводительной крио-ЭМ с контролируемой толщиной льда21. Микроструктурный чип был изготовлен с использованием методов микроэлектромеханической системы (MEMS), которые могут манипулировать структурой и размерами чипа в зависимости от целей визуализации. Микроструктурированный чип с окнами GO имеет структуру микролунки, которая может быть заполнена раствором образца, а глубина микролунки может регулироваться для контроля толщины стекловидного льда. Сильное сродство GO к биомолекулам повышает концентрацию биомолекул для визуализации, повышая эффективность структурного анализа. Кроме того, микроструктурированный чип состоит из Si-кадра, который обеспечивает высокую механическую стабильность сетки19, что делает его идеальным для обработки чипа во время процедур подготовки образцов и крио-ЭМ визуализации. Таким образом, микроструктурированный чип с окнами GO, изготовленными по методам MEMS, обеспечивает надежность и воспроизводимость крио-ЭМ пробоподготовки, что может обеспечить эффективный и высокопроизводительный анализ структуры на основе крио-ЭМ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>443778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Park Systems, South Korea</td>
			<td>NX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aligner</td>
			<td>Midas System, South Korea</td>
			<td>MDA-600S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials USA Corp., USA</td>
			<td>184411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM holder</td>
			<td>Gatan, USA</td>
			<td>626 single tilt cryo-EM holder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-plunging machine</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)</td>
			<td>FEI Company, USA</td>
			<td>Helios NanoLab 650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Ted Pella Inc., USA</td>
			<td>PELCO easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene oxide (GO) solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>763705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>10226590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)</td>
			<td>Centrotherm, Germany</td>
			<td>LPCVD E1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maP1205 positive PR</td>
			<td>Micro resist technology, Germany</td>
			<td>A15139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH), flake</td>
			<td>DAEJUNG CHEMICALS &#38; METALS Co. LTD., South Korea</td>
			<td>6597-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raman Spectrometer</td>
			<td>NOST, South Korea</td>
			<td>Confocal Micro Raman System HEDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive ion etcher (RIE)</td>
			<td>Scientific Engineering, South Korea</td>
			<td>Lab-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>SUPRA 55VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafer</td>
			<td>JP COMMERCE, South Korea</td>
			<td></td>
			<td>4&#34; Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Dong Ah Trade Corp., South Korea</td>
			<td>ACE-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy

Основным ограничением для эффективного и высокопроизводительного структурного анализа биомолекул с использованием криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) является сложность подготовки крио-ЭМ образцов с контролируемой толщиной льда на наноуровне. Микросхема на основе кремния (Si), которая имеет регулярный массив микроотверстей с окном оксида графена (GO), узорчатым на пленке нитрида кремния с контролируемой толщиной (SixNy), была разработана с применением методов микроэлектромеханической системы (MEMS). УФ-фотолитография, химическое осаждение из паровой фазы, мокрое и сухое травление тонкой пленки, капельное литье 2D нанолистовых материалов использовались для массового производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Глубина микроотверстей регулируется для контроля толщины льда по требованию, в зависимости от размера образца для крио-ЭМ-анализа. Благоприятное сродство GO к биомолекулам концентрирует биомолекулы, представляющие интерес, в микро-отверстии во время крио-ЭМ пробоподготовки. Микроструктурированный чип с окнами GO обеспечивает высокопроизводительную крио-ЭМ визуализацию различных биологических молекул, а также неорганических наноматериалов.

Микроструктурированный чип с окнами GO был изготовлен путем изготовления MEMS и передачи нанолиста 2D GO. Чипы для микроструктурирования производились серийно, причем около 500 чипов производились из одной пластины 4 (рисунок 1B и рисунок 2A, B). Констру?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy

Недавно разработанный микроструктурированный чип с окнами оксида графена изготовлен с применением методов микроэлектромеханической системы, что позволяет эффективно и высокопроизводительно криогенную электронную микроскопию визуализировать различные биомолекулы и наноматериалы.

Изготовление микроструктурированного чипа с контролируемой толщиной для высокопроизводительной криогенной электронной микроскопии

A major limitation for the efficient and high-throughput structure analysis of biomolecules using cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is the ...

Этот протокол важен для регулирования толщины размера изображения на наноуровне для успешного наблюдения белков и наноматериалов разных размеров с использованием криоЭМ. Технология изготовления Mem позволяет массово производить микрочип. Это также позволяет выбирать глубины и конструкции микроструктурных скважин. В зависимости от экспериментальных целей.Этот метод может способствовать повышению эффективности высокопроизводительного 3D-анализа структуры биомолекул, который используется для коммерческого открытия лекарств, а затем тонкие пластины и микрочипы с риском ухода за кремниевыми нитромпонами могут быть сложными. Важно не сгибать пластину и не прикладывать силы, перпендикулярные окну нитрата кремния. Начните формировать фоторезистент или PR, покрывая осажденную кремниевыми пластинами кремния раствором гексаметилдисилазана, а затем поручайте пластину при 3000 об/мин в течение 30 секунд на спиновом кодере.Выпекайте пластину с покрытием при температуре 95 градусов Цельсия в течение 30 секунд на горячей плите, чтобы сделать поверхность воды гидрофобной и обеспечить хорошие характеристики покрытия с PR. Далее открутите с положительным PR и выпекайте ее при 100 градусах Цельсия в течение 90 секунд. Отжимное покрытие PR имеет толщину 500 нанометров. Подвергайте пластину с покрытием PR ультрафиолетовому свету в течение пяти секунд через хромовую маску с помощью элайнера.Разработайте PR на одну минуту с помощью разработчика и дважды промойте, погружая пластину в деионизированную воду. Затем высушите пластину с рисунком PR, выдувая газообразный азот на поверхность воды. Следуя шаблону PR. Используйте лабораторный реактивный ионный травилатор с радиочастотной мощностью 50 Вт и с газообразным гексафторидом серы в три стандартных кубических сантиметра в минуту.Травить обнаженный нитрид кремния со скоростью шесть ангстрем в секунду. Устраните PR, погрузив пластину с рисунком нитрида кремния в ацетон при комнатной температуре на 30 минут. Затем промыть пластину дважды в деионизированной воде и высушить пластину газообразным азотом.Чтобы травить обнаженный си, погрузите пластину с рисунком нитрида кремния в свежеприготовленный раствор гидроксида калия. При непрерывном перемешивании до тех пор, пока отдельно стоящие окна нитрида кремния можно наблюдать на противоположной стороне узорчатой пластины. Очистите травленую пластину, окунув ее несколько раз в деионизированную водяную баню.Затем высушите пластину на воздухе. Чтобы устранить остатки травления, слегка прижмите пинцетом границы чип-массива и получите массив микроструктурированных. Затем погрузите чип-массив в свежеприготовленный раствор гидроксида калия на 30 секунд с последующим двойным ополаскиванием, продувая стружку газообразным азотом и высушивая их на воздухе в течение одного часа.Для твердой опоры подготовьте заготовку 525-микрометровой кремниевой пластины со спиновым покрытием, как показано ранее. Прикрепляется к лучу измельчителя на кремниевой пластине перед выпечкой пластины и следуйте процедуре, описанной ранее, чтобы получить микроструктурную кремниевую пластину. Устраните PR, погрузив чип-набор шаблона в один метиловый раствор чистого литтанола при температуре 60 градусов Цельсия в течение ночи.На следующий день дважды промойте чипсет деионизированной водой. После высыхания чипсета рисунка азотом устраните остатки PR с помощью кислородно-плазменного процесса с использованием 100 стандартных кубических сантиметров в минуту газообразного кислорода при радиочастотной мощности 150 Вт в течение одной минуты с помощью реакционноспособного ионного травильщика. Позже погрузите микроструктурированные чипы в раствор гидроксида калия на 30 секунд, чтобы полностью устранить остатки PR.Затем промойте и полностью высушите чипсет. Разбавить два миллиграмма на миллилитр оксида графена или раствора в 10 раз деионизированной водой и обработать ультразвуком разбавленный раствор в течение 10 минут, чтобы разбить агрегаты листов. Затем центрифугируют к разбавленному раствору в 300 раз г в течение 30 секунд при комнатной температуре.Используйте тлеющий разрядник со скоростью 15 миллионов ампер, чтобы разряжать вытравленную кремнием сторону микрорайна в течение одной минуты и отображать поверхность чипа с положительным зарядом. Когда все будет готово, опустите три микролитра раствора на сторону тлеющего разряда микроструктурного чипа. Через одну минуту промокните лишний раствор на чипе фильтровальной бумагой.Вымойте перенесенный чип деионизированными каплями воды на парафиновой пленке и промокните излишки фильтровальной бумагой. Повторите процедуру капельного литья дважды на перенесенной стороне и один раз на противоположной стороне. Высушите перенесенный чип при комнатной температуре в течение ночи.Во время процедуры фотолитографии конструкциями микроструктурных чипов манипулировали с использованием различных конструкций хромовой маски. Количество и размеры отдельно стоящих мембран нитрида кремния контролировались. Было замечено, что изготовленные микроструктурированные чипы могут иметь до 25 000 подвесных отверстий.Спектр рамена у окна отображал репрезентативные пики Кроме того, многоцелевые гексагональные дефракционные паттерны указывали, что окна состояли из многослойности Структура и глубина микроотверли с окнами изучались с помощью сканирующей электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. На снимках, подтверждающих возможность конструирования микрорайона с окнами, наблюдалась структура микрооткрытия с окном. С помощью микроструктурированного чипа несколько биологических образцов и неорганических наночастиц были визуализированы с помощью криоэлектронного микроскопа.Оптимизация условий, таких как чистая толщина покрытия с использованием интенсивности и времени разработки микроструктур в зависимости от размера и дизайна узоров, важна. Применяя нано-методы, такие как FIB или даже литографен, могут быть получены меньшие микрометровые паттерны, которые могут расширить применение этого микроустройства там, где оно используется с другими аналитическими методами.

Research

JoVE Journal

Engineering

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Изготовление ворот-перестраиваемых графена устройств для сканирующей туннельной микроскопии исследований с кулоновских примесей

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Preparation of Liquid-exfoliated Transition Metal Dichalcogenide Nanosheets with Controlled Size and Thickness: A State of the Art Protocol

Получение жидкостным слущенных переходных металлов дихалькогенидных нанолистов с контролируемыми размера и толщины: Государство Протокола Арт

We summarize recent advances in the production of liquid-exfoliated transition metal dichalcogenide (TMD) nanosheets with controlled size and thickness. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Изучение динамических процессов наноразмерных объектов в жидкости с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Метод для получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов в просвечивающей электронной микроскопии

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

Расширение электронного впрыска и экситонных родов для чисто синий квантовых точках светоизлучающие диоды, вводя частично окисленного алюминия катод

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Однозначных нанометр электронно лучевая литография с исправления аберраций сканирования просвечивающий электронный микроскоп

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

High Throughput Analysis of Liquid Droplet Impacts

Высокоэффективный анализ воздействия жидких капель

Experimental studies of liquid drop impacts on surfaces are often restricted in their scope due to the large range of possible experimental parameters ...

Fabrication and Characterization of Thickness Mode Piezoelectric Devices for Atomization and Acoustofluidics

Изготовление и характеристика режима толщины Piezoelectric устройства для атомизации и acoustofluidics

We present a technique to fabricate simple thickness mode piezoelectric devices using lithium niobate (LN). Such devices have been shown to atomize liquid ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

В Situ передачи электронной микроскопии с смещения и изготовление асимметричных перекладин на основе смешанных фаз -VOх

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Cryogenic Liquid Jets for High Repetition Rate Discovery Science

Криогенные жидкостные струи для открытия с высокой частотой повторения

This protocol presents a detailed procedure for the operation of continuous, micron-sized cryogenic cylindrical and planar liquid jets. When operated as ...