Name: fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-04-21T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

M.-H.K., S.K., M.L. ve J.P., Temel Bilimler Enstitüsü'nün mali desteğini kabul etmektedir (Hibe No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. ve J.P., Seul Ulusal Üniversitesi (2021) aracılığıyla Yaratıcı-Öncü Araştırmacılar Programı'nın finansal desteğini ve Kore hükümeti tarafından finanse edilen NRF hibesini (MSIT; Hibe No. NMG-2020R1A2C2101871 ve NMG-2021M3A9I4022936). M.L. ve J.P., POSCO TJ Park Vakfı'nın POSCO Bilim Bursu'nun mali desteğini ve Kore hükümeti tarafından finanse edilen NMK hibesini (MSIT; Hibe No. NMG-2017R1A5A1015365). J.P., Kore hükümeti (MSIT; Hibe No. NMK-2020R1A6C101A183) ve Seul Ulusal Üniversitesi Mühendislik Fakültesi ve Tıp Fakültesi tarafından Disiplinlerarası Araştırma Girişimleri Programları (2021). M.-H.K., Kore hükümeti (MSIT; Hibe No. NMG-2020R1I1A1A0107416612). Yazarlar, Seul Ulusal Üniversitesi Makromoleküler ve Hücre Görüntüleme Merkezi (SNU CMCI) personeline ve ekibine, kriyo-EM deneyleri ile yorulmak bilmeyen çabaları ve azimleri için teşekkür eder. Yazarlar, FIB-SEM deneylerine yardım için Ulusal Üniversitelerarası Araştırma Tesisleri Merkezi'nden S. J. Kim'e teşekkür ediyor.

1. GO pencereli mikro desenli çip imalatı (Şekil 1)
<ol><li>Silisyum nitrürü biriktirin.<ol><li>830 ° C'de düşük basınçlı kimyasal buhar biriktirme (LPCVD) ve 150 mTorr basınç kullanarak, 170 sccm diklorosilane (SiH2Cl2, DCS) ve 38 sccm amonyak (NH3) akışı altında Si gofretin her iki tarafında (4 inç çapında ve 100 μm kalınlıkta) düşük gerilimli silikon nitrür (SixNy) birik...

<ol>
	<li>Dillard, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+at+the+cutting+edge+of+cryo-electron+microscopy.">Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+improve+protein+distribution+on+holey+carbon+cryo-EM+supports.">Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Xu, B. J., Developments Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications,+and+prospects+of+cryo-electron+microscopy.">applications, and prospects of cryo-electron microscopy.</a> Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>Darrow, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chameleon:+next+generation+sample+preparation+for+cryoEM+based+on+spotiton.">Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton.</a> Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).</li><li>Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+gating+the+high-conductance+Ca2+-activated+K++channel.">Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel.</a> Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+activated+GLP-1+receptor+in+complex+with+a+G+protein.">Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein.</a> Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).</li><li>Shaik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+coreceptor+recognition+by+HIV-1+envelope+spike.">Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike.</a> Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+inactivated+SARS-CoV-2+with+postfusion+spikes+revealed+by+cryo-EM+and+cryo-ET.">The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET.</a> Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).</li><li>Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+energy+materials+by+cryogenic+electron+microscopy.">Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy.</a> Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).</li><li>Li, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+sensitive+battery+materials+and+Interfaces+revealed+by+cryo-electron+microscopy.">Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy.</a> Science. 358 (6362), 506-510 (2017).</li><li>Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience.">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+synthesis+of+palladium+species+confined+in+a+small-pore+zeolite+via+full+ion-exchange+investigated+by+cryogenic+electron+microscopy.">Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).</li><li>Baumgartner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+growth+of+magnetite+from+solution.">Nucleation and growth of magnetite from solution.</a> Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).</li><li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids.">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Kang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide-supported+microwell+grids+for+preparing+cryo-EM+samples+with+controlled+ice+thickness.">Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).</li><li>Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+safe+graphene+preparation+on+solution+based+platform.">Facile and safe graphene preparation on solution based platform.</a> Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).</li><li>Yang, C., Pham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+study+of+silicon+nitride+films+deposited+by+LPCVD+and+PECVD.">Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD.</a> Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).</li><li>Olson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+LPCVD+process+conditions+for+the+deposition+of+low+stress+silicon+nitride.+Part+I:+preliminary+LPCVD+experiments.">Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments.</a> Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).</li><li>Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+low+stress+silicon+nitride+thin+film+and+its+application+in+surface+micromachining+device+structures.">Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures.</a> Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).</li><li>Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrostatic+actuator+for+fatigue+testing+of+low-stress+LPCVD+silicon+nitride+thin+films.">An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).</li><li>Shafikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+ultrathin+Si3N4+membranes+by+compressive+surface+stress.">Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).</li><li>Ng, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+and+modelling+the+wetting+properties+of+III-V+semiconductor+surfaces+using+re-entrant+nanostructures.">Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures.</a> Scientific Reports. 8, 3544 (2018).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-templated+silver+nanoparticle+arrays+photopolymerized+in+zero-mode+waveguides.">Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides.</a> Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).</li><li>Escobedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+nanohole+array+based+sensing:+a+review.">On-chip nanohole array based sensing: a review.</a> Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).</li></ol>

GO pencereli mikro desenli çipler üretmek için mikrofabrikasyon süreçleri burada tanıtılmaktadır. Fabrikasyon mikro desenli çip, analiz edilecek malzemenin boyutuna bağlı olarak mikro deliğin derinliğini GO pencereleri ile kontrol ederek vitreus buz tabakasının kalınlığını düzenlemek için tasarlanmıştır. GO pencereli mikro desenli bir çip, bir dizi MEMS tekniği ve bir 2D nanosheet transfer yöntemi kullanılarak üretildi (Şekil 1). MEMS imalat tekniğini kullanma...

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), proteinlerin üç boyutlu (3D) yapısını doğal hallerinde 1,2,3,4 olarak çözmek için geliştirilmiştir. Teknik, proteinleri ince bir vitreus buzu tabakasına (10-100 nm) sabitlemeyi ve bir iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak rastgele yönlendirilmiş proteinlerin projeksiyon görüntülerini elde etmeyi içerir. Binlerce ila milyonlarca projeksiyon görüntüsü elde edilir ve hesaplama algoritmaları ile proteinin 3B yapısını yeniden yapılandırmak için kullanılır 5,6. Cryo-EM ile başarılı bir analiz için, kriyo-numune hazırlama, lekelenme koşullarını, nemi ve sıcaklığı kontrol eden ekipmanın daldırılması-dondurulmasıyla otomatikleştirilmiştir. Numune çözeltisi, delikli bir karbon membranlı bir TEM ızgarasına yüklenir, fazla çözeltiyi gidermek için art arda lekelenir ve daha sonra ince, vitreus buz 1,5,6 üretmek için sıvı etan ile dondurularak dondurulur. Kriyo-EM'deki gelişmeler ve numune hazırlama7'nin otomasyonu ile kriyo-EM, virüsler için zarf proteinleri ve hücre zarındaki iyon kanalı proteinleri de dahil olmak üzere proteinlerin yapısını çözmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır 8,9,10. Patojenik viral partiküllerin zarf proteinlerinin yapısı, viral enfeksiyon patolojisini anlamanın yanı sıra,COVID-19 pandemisine neden olan SARS-CoV-2 11 gibi tanı sistemini ve aşıları geliştirmek için önemlidir. Ayrıca, kriyo-EM teknikleri son zamanlarda pil12,13,14 ve katalitiksistemler 14,15'te kullanılan ışına duyarlı malzemelerin görüntülenmesi ve inorganik malzemelerin 16 çözelti halindeki yapısının analiz edilmesi gibi malzeme bilimlerine uygulanmıştır.
Kriyo-EM ve ilgili tekniklerdeki gözle görülür gelişmelere rağmen, kriyo-numune hazırlamada sınırlamalar vardır ve bu da yüksek verimli 3D yapı analizini engellemektedir. Optimum kalınlığa sahip bir vitreus buz filmi hazırlamak, biyolojik malzemelerin atomik çözünürlüğe sahip 3D yapısını elde etmek için özellikle önemlidir. Buz, buz tarafından dağılan elektronlardan gelen arka plan gürültüsünü en aza indirecek ve elektron ışını yolu1,17 boyunca biyomoleküllerin üst üste binmesini yasaklamak için yeterince ince olmalıdır. Bununla birlikte, buz çok inceyse, protein moleküllerinin tercih edilen yönlerde hizalanmasına veya 18,19,20'yi denatüre etmesine neden olabilir. Bu nedenle, vitreus buzunun kalınlığı, ilgilenilen malzemenin boyutuna bağlı olarak optimize edilmelidir. Ayrıca, numune hazırlanması ve hazırlanan TEM ızgaralarında buz ve protein bütünlüğünün manuel olarak taranması için tipik olarak kapsamlı çaba gereklidir. Bu süreç son derece zaman alıcıdır ve bu da yüksek verimli 3D yapı analizi için verimliliğini engeller. Bu nedenle, kriyo-EM numune hazırlamanın güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğindeki gelişmeler, kriyo-EM'nin yapısal biyoloji ve ticari ilaç keşfinde ve ayrıca malzeme biliminde kullanımını artıracaktır.
Burada, kontrollü buz kalınlığı21 ile yüksek verimli kriyo-EM için tasarlanmış grafen oksit (GO) pencereli mikro desenli bir çip yapmak için mikrofabrikasyon süreçlerini tanıtıyoruz. Mikro desenli çip, görüntüleme amaçlarına bağlı olarak çipin yapısını ve boyutlarını manipüle edebilen mikroelektromekanik sistem (MEMS) teknikleri kullanılarak üretilmiştir. GO pencereli mikro desenli çip, numune çözeltisi ile doldurulabilen bir mikro kuyucuk yapısına sahiptir ve vitreus buzunun kalınlığını kontrol etmek için mikro kuyucuğun derinliği düzenlenebilir. GO'nun biyomoleküller için güçlü afinitesi, görselleştirme için biyomoleküllerin konsantrasyonunu arttırır ve yapı analizinin verimliliğini arttırır. Ayrıca, mikro desenli çip, ızgara19 için yüksek mekanik stabilite sağlayan bir Si çerçevesinden oluşur ve bu da numune hazırlama prosedürleri ve kriyo-EM görüntüleme sırasında çipin işlenmesi için idealdir. Bu nedenle, MEMS teknikleri tarafından üretilen GO pencereli mikro desenli bir çip, kriyo-EM numune hazırlamanın güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlar, bu da kriyo-EM'ye dayalı verimli ve yüksek verimli yapı analizini mümkün kılar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>443778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Park Systems, South Korea</td>
			<td>NX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aligner</td>
			<td>Midas System, South Korea</td>
			<td>MDA-600S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials USA Corp., USA</td>
			<td>184411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM holder</td>
			<td>Gatan, USA</td>
			<td>626 single tilt cryo-EM holder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-plunging machine</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)</td>
			<td>FEI Company, USA</td>
			<td>Helios NanoLab 650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Ted Pella Inc., USA</td>
			<td>PELCO easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene oxide (GO) solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>763705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar, USA</td>
			<td>10226590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)</td>
			<td>Centrotherm, Germany</td>
			<td>LPCVD E1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maP1205 positive PR</td>
			<td>Micro resist technology, Germany</td>
			<td>A15139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH), flake</td>
			<td>DAEJUNG CHEMICALS &#38; METALS Co. LTD., South Korea</td>
			<td>6597-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raman Spectrometer</td>
			<td>NOST, South Korea</td>
			<td>Confocal Micro Raman System HEDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive ion etcher (RIE)</td>
			<td>Scientific Engineering, South Korea</td>
			<td>Lab-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td>SUPRA 55VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafer</td>
			<td>JP COMMERCE, South Korea</td>
			<td></td>
			<td>4&#34; Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Dong Ah Trade Corp., South Korea</td>
			<td>ACE-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td>JEOL, Japan</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanılarak biyomoleküllerin verimli ve yüksek verimli yapı analizi için önemli bir sınırlama, nano ölçekte kontrollü buz kalınlığına sahip kriyo-EM numunelerinin hazırlanmasının zorluğudur. Kalınlığı kontrol edilen silikon nitrür (SixNy) filmi üzerine desenli grafen oksit (GO) pencereli düzenli bir mikro delik dizisine sahip olan silikon (Si) bazlı çip, mikroelektromekanik sistem (MEMS) teknikleri uygulanarak geliştirilmiştir. UV fotolitografisi, kimyasal buhar birikimi, ince filmin ıslak ve kuru aşındırılması ve 2D nanosheet malzemelerin damla dökümü, GO pencereli mikro desenli çiplerin seri üretimi için kullanılmıştır. Mikro deliklerin derinliği, kriyo-EM analizi için numunenin boyutuna bağlı olarak, talep üzerine buz kalınlığını kontrol etmek için düzenlenir. GO'nun biyomoleküllere olan olumlu afinitesi, kriyo-EM numune hazırlama sırasında ilgilenilen biyomolekülleri mikro delik içinde yoğunlaştırır. GO pencereli mikro desenli çip, çeşitli biyolojik moleküllerin yanı sıra inorganik nanomalzemelerin yüksek verimli kriyo-EM görüntülemesini sağlar.

GO pencereli mikro desenli bir çip, MEMS üretimi ve 2D GO nanosheet transferi ile üretildi. Mikro modelleme için çipler seri olarak üretildi ve gofretteki bir 4'ten yaklaşık 500 çip üretildi (Şekil 1B ve Şekil 2A, B). Mikro desenli çiplerin tasarımları, fotolitografi prosedürü sırasında krom maskesinin farklı tasarımları kullanılarak manipüle edilebilir (Şekil 2). Fabrikasyon mikro desenli ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy

Grafen oksit pencereli yeni geliştirilen mikro desenli çip, mikroelektromekanik sistem teknikleri uygulanarak üretilir ve çeşitli biyomoleküllerin ve nanomalzemelerin verimli ve yüksek verimli kriyojenik elektron mikroskopisi görüntülemesini sağlar.

Yüksek Verimli Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Kontrollü Kalınlığa Sahip Mikro Desenli Çip İmalatı

A major limitation for the efficient and high-throughput structure analysis of biomolecules using cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is the ...

Bu protokol, kriyo EM kullanarak proteinleri ve farklı boyutlardaki nano malzemeleri başarılı bir şekilde gözlemlemek için nano ölçekte resim boyutunun kalınlığını düzenlemek için önemlidir. Mem'in üretim tekniği, mikroçipin seri üretimine izin verir. Ayrıca mikro desen kuyularının derinliklerinin ve tasarımlarının seçilmesini sağlar. Deneysel amaçlara bağlı olarak.Bu teknik, ticari ilaç keşfi için kullanılan biyomoleküllerin yüksek verimli 3D yapı analizinin verimliliğini arttırmaya katkıda bulunabilir ve daha sonra silikon nitro membranları riske atan ince gofretler ve mikroçipler zor olabilir. Gofreti bükmemek veya silikon nitrat penceresine dik kuvvetler uygulamamak önemlidir. Bir silikon nitrür birikmiş silikon gofreti hekzametildikolayan çözeltisi ile kaplayarak fotoğraf direncini veya PR'yi modellemeye başlayın ve ardından gofreti bir spin kodlayıcıda 30 saniye boyunca 3000 RPM'de döndürün.Su yüzeyini hidrofobik hale getirmek ve PR ile iyi bir kaplama performansı sağlamak için kaplanmış gofreti sıcak plaka üzerinde 30 saniye boyunca 95 santigrat derecede pişirin. Daha sonra, gofreti pozitif bir PR ile döndürün ve 90 saniye boyunca 100 santigrat derece pişirin. Spin kaplı bir PR, 500 nanometre kalınlığa sahiptir. PR kaplı gofreti, hizalayıcı kullanarak krom maskesi aracılığıyla beş saniye boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın.Bir geliştirici kullanarak PR'ı bir dakika boyunca geliştirin ve gofreti deiyonize suya batırarak iki kez durulayın. Daha sonra PR desenli gofreti azot gazını su yüzeyine üfleyerek kurutun. PR'ın desenini takiben. 50 watt'lık bir radyo frekansı gücünde ve dakikada üç standart santimetreküpte kükürt hekzaflorür gazı ile laboratuarda oluşturulmuş bir reaktif iyon kazıyıcı kullanın.Maruz kalan silikon nitrürü saniyede altı angstrom hızında kazımak. Silisyum nitrür desenli gofreti oda sıcaklığında 30 dakika boyunca asetona batırarak PR'ı ortadan kaldırın. Ardından gofret deiyonize suda iki kez durulanır ve gofret azot gazı ile kurutulur.Maruz kalan si'yi kazımak için, silikon nitrür desenli gofreti taze hazırlanmış potasyum hidroksit çözeltisine batırın. Desenli gofretin karşı tarafında serbest duran silikon nitrür pencereleri gözlemlenene kadar sürekli karıştırılır. Kazınmış gofreti deiyonize bir su banyosuna birkaç kez batırarak temizleyin.Sonra gofreti havada kurutun. Aşındırma kalıntılarını ortadan kaldırmak için, çip dizisinin sınırlarını bir cımbızla hafifçe bastırın ve mikro desenli olacak bir dizi çip elde edin. Daha sonra talaş dizisini taze hazırlanmış potasyum hidroksit çözeltisine 30 saniye batırın, ardından iki kez durulayın, talaşları azot gazı ile üfleyin ve bir saat boyunca havada kurutun.Katı destek için, daha önce gösterildiği gibi sıkma kaplamalı boş bir 525 mikrometre silikon gofret hazırlayın. Gofreti pişirmeden önce silikon gofret üzerindeki yontucu ışınına tutturulur ve mikromodel silikon gofreti elde etmek için daha önce açıklandığı gibi prosedürü izleyin. Desen çipi setini bir metil iki saf littanol çözeltisine gece boyunca 60 santigrat derecede batırarak PR'yi ortadan kaldırın.Ertesi gün, çip setini deiyonize su ile iki kez durulayın. Desen çipi seti azotla kuruttuktan sonra, reaktif iyon kazıyıcı ile bir dakika boyunca 150 watt'lık bir radyo frekansı gücünde dakikada 100 standart santimetreküp oksijen gazı kullanan bir oksijen plazma işlemi ile PR kalıntılarını ortadan kaldırın. Daha sonra, PR kalıntılarını tamamen ortadan kaldırmak için mikro desenli cipsleri 30 saniye boyunca potasyum hidroksit çözeltisine batırın.Daha sonra talaş setini durulayın ve tamamen kurulayın. Mililitre grafen oksit başına iki miligram veya çözelti 10 katını deiyonize su ile seyreltin ve tabakaların agregalarını parçalamak için seyreltilmiş çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra seyreltilmiş çözeltiye oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın.Mikro desen çipinin silikonla kazınmış tarafını bir dakika boyunca parlatmak ve çipin yüzeyini pozitif bir yükle oluşturmak için 15 milyon amperde bir kızdırma deşarjı kullanın. İşiniz bittiğinde, çözeltinin üç mikrolitresini mikrodesen çipinin kızdırma boşaltma tarafına bırakın. Bir dakika sonra, talaş üzerindeki fazla çözeltiyi filtre kağıdı ile lekeleyin.Aktarılan çipi bir parafin film üzerinde deiyonize su damlacıkları ile yıkayın ve fazlalığı filtre kağıdı ile lekeleyin. Damla döküm prosedürünü aktarılan tarafta iki kez ve karşı tarafta bir kez tekrarlayın. Aktarılan çipi gece boyunca oda sıcaklığında kurutun.Fotolitografi prosedürü sırasında, mikro desen çiplerinin tasarımları, krom maskesinin farklı tasarımları kullanılarak manipüle edildi. Serbest duran silikon nitrür membranlarının sayıları ve boyutları kontrol edildi. Fabrikasyon mikro desenli çiplerin 25.000'e kadar asılı deliğe sahip olabileceği gözlendi.Penceredeki ramen spektrumu, ek olarak, çarpma yönelimli altıgen kırılma desenlerinin temsili zirvelerini gösterdi Pencerelerin çok katmanlı olduğunu gösterdi Pencereli mikro deliğin yapısı ve derinliği, taramalı elektron mikroskobu ve atomik kuvvet mikroskobu ile incelendi. Pencerelerle birlikte mikro deliğin kuyu tipi bir yapısı, pencereli mikro desen çipinin tasarım olasılığını doğrulayan görüntülerde gözlenmiştir. Mikro desenli çip yardımıyla, kriyo elektron mikroskobu ile birkaç biyolojik örnek ve inorganik nanopartikül görüntülendi.Saf kaplama kalınlığı gibi koşulların, desenlerin boyutuna ve tasarımına bağlı olarak yoğunluk ve mikro desen için geliştirme süresi kullanılarak optimize edilmesi önemlidir. FIB veya hatta lito grafen gibi nano püskürtme tekniklerini daha küçük uygulayarak bazı mikrometre desenleri üretilebilir ve bu da bu mikro cihazın diğer analitik tekniklerle birlikte kullanıldığı uygulamaları genişletebilir.

Research

JoVE Journal

Engineering

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Coulomb İmpürite Tarama Tünel Mikroskobu Çalışmaları Kapısı-ayarlanabilir Grafen Cihazlarının İmalatı

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Preparation of Liquid-exfoliated Transition Metal Dichalcogenide Nanosheets with Controlled Size and Thickness: A State of the Art Protocol

Sıvı dağılmış Geçiş Metal dikalkogenid Kontrollü Boyutu Nanosheets ve Kalınlığının Hazırlanması: Sanat Protokolü Bir Devlet

We summarize recent advances in the production of liquid-exfoliated transition metal dichalcogenide (TMD) nanosheets with controlled size and thickness. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak Sıvı Nano-ölçekli Nesnelerin dinamik Süreçlerinin İncelenmesi

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

Gelişmiş elektron enjeksiyon ve Exciton hapsi için kısmen oksitlenmiş alüminyum katot tanıtımı tarafından saf mavi kuantum nokta ışık - yayan diyotlar

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Tek basamaklı nanometre elektron ışını litografi bir sapma düzeltilmiş tarama transmisyon elektron mikroskobu ile

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

High Throughput Analysis of Liquid Droplet Impacts

Sıvı Damlacık Etkilerinin Yüksek Elde LiAnalizi

Experimental studies of liquid drop impacts on surfaces are often restricted in their scope due to the large range of possible experimental parameters ...

Fabrication and Characterization of Thickness Mode Piezoelectric Devices for Atomization and Acoustofluidics

Atomizasyon ve Acoustofluidics için Kalınlık Modu Piezoelektrik Cihazların İmalatı ve Karakterizasyonu

We present a technique to fabricate simple thickness mode piezoelectric devices using lithium niobate (LN). Such devices have been shown to atomize liquid ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Karışık Fazlı a -VOx'e Dayalı Asimetrik Çapraz Çubukların Önyargılı ve İmalatlı Yerinde İletim Elektron Mikroskopisi

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Cryogenic Liquid Jets for High Repetition Rate Discovery Science

Yüksek Tekrarlama Hızı Keşif Bilimi için Kriyojenik Sıvı Jetler

This protocol presents a detailed procedure for the operation of continuous, micron-sized cryogenic cylindrical and planar liquid jets. When operated as ...