Name: a competent hepatocyte model examining hepatitis b virus entry through sodium taurocholate cotransporting polypeptide as a therapeutic target
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target at JoVE.com

이 연구 프로젝트는 Mahidol University와 태국 과학 연구 및 혁신 (TSRI)이 A. Wongkajornsilp 및 K. Sa-ngiamsuntorn에게 별도로 수여합니다. 이 작업은 경쟁력을위한 프로그램 관리 단위 (보조금 번호 C10F630093)를 통해 국가 고등 교육 과학 연구 및 혁신 정책위원회 사무국에서 재정적으로 지원했습니다. A. Wongkajornsilp는 Mahidol University의 Faculty of Medicine Siriraj Hospital의 Chalermprakiat 보조금을 받았습니다. 저자는 ITC 기술에 대한 그녀의 도움에 대해 Sawinee Seemakhan (Mahidol University 과학 학부 약물 발견 우수 센터)에게 감사드립니다.

알림: 다음 절차는 Class II 생물학적 위험 흐름 후드 또는 층류 후드에서 수행해야 합니다. HBV의 취급은 IRB (MURA2020/1545)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 용액, 시약, 장비 및 세포주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 숙주세포(성숙간세포) 준비
<ol><li>간세포(3.75 × 105 세포 HepaRG 또는 imHC)를 배?...

<ol>
	<li>Levrero, M., Zucman-Rossi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+HBV-induced+hepatocellular+carcinoma.">Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).</li><li>Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+anti-HBV+agents+and+their+resistance.">Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance.</a> Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).</li><li>Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+for+hepatitis+B:+New+treatment+options+necessitate+reappraisal+of+traditional+endpoints.">Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints.</a> Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).</li><li>Volz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entry+inhibitor+Myrcludex-B+efficiently+blocks+intrahepatic+virus+spreading+in+humanized+mice+previously+infected+with+hepatitis+B+virus.">The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus.</a> Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).</li><li>Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antivirals+in+clinical+development+for+chronic+hepatitis+B+infection.">Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection.</a> Viruses. 13 (6), 1169 (2021).</li><li>Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HBV+and+HDV:+New+Treatments+on+the+Horizon.">HBV and HDV: New Treatments on the Horizon.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+identification+of+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+using+HepG2+cells+overexpressing+a+membrane+transporter+NTCP.">Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).</li><li>Tong, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+NTCP+as+an+HBV+receptor:+the+beginning+of+the+end+or+the+end+of+the+beginning.">Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning.</a> Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).</li><li>Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+HepG2-derived+cells+expressing+cytochrome+P450s+for+assessing+metabolism-associated+drug-induced+liver+toxicity.">Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).</li><li>Thongsri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibited+hepatitis+B+viral+entry+through+NTCP+binding.">Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding.</a> Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).</li><li>Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+hepatocyte-like+cell+line+(imHC)+accommodated+complete+viral+lifecycle,+viral+persistence+form,+cccDNA+and+eventual+spreading+of+a+clinically-isolated+HBV.">An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV.</a> Viruses. 11 (10), 952 (2019).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).</li><li>Kaneko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tricyclic+polyketide,+Vanitaracin+A,+specifically+inhibits+the+entry+of+hepatitis+B+and+D+viruses+by+targeting+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide.">A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide.</a> Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).</li><li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products.">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay:+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies.">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycosylation+of+the+Na+-taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP)+determines+its+trafficking+and+stability+and+is+required+for+hepatitis+B+virus+infection.">N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection.</a> PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).</li><li>Tsukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+hepatitis+B+and+D+virus+entry+inhibitors,+proanthocyanidin+and+its+analogs,+that+directly+act+on+the+viral+large+surface+proteins.">A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins.</a> Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).</li><li>Klumpp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+a+hepatitis+B+virus+replication+inhibitor+bound+to+the+viral+core+protein.">High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).</li><li>Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+inhibition+of+NTCP+by+myrcludex+B.">Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B.</a> JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).</li><li>Saso, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+identify+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+by+AlphaScreen+technology+targeting+the+envelope-receptor+interaction.">A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).</li><li>Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+characterization+of+recombinant+proteins.">Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+virtual+screening+protocol+for+in+silico+identification+of+potential+thyroid+disrupting+chemicals+targeting+transthyretin.">Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin.</a> Environmental Science &amp; Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).</li><li>Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+protein-ligand+interactions:+mechanisms,+models,+and+methods.">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).</li><li>Sureau, C., Salisse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+heparan+sulfate+binding+site+essential+to+infectivity+overlaps+with+the+conserved+hepatitis+B+virus+A-determinant.">A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant.</a> Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).</li><li>Herrscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+entry+into+HepG2-NTCP+cells+requires+clathrin-mediated+endocytosis.">Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis.</a> Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Mayati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarization+of+human+hepatoma+HepaRG+cells+in+response+to+forskolin.">Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).</li><li>Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).</li><li>Seeger, C., Mason, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium-dependent+taurocholic+cotransporting+polypeptide:+a+candidate+receptor+for+human+hepatitis+B+virus.">Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus.</a> Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).</li><li>Seeger, C., Sohn, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hepatitis+B+virus+with+CRISPR/Cas9.">Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).</li><li>Ni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+and+D+viruses+exploit+sodium+taurocholate+co-transporting+polypeptide+for+species-specific+entry+into+hepatocytes.">Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes.</a> Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).</li><li>Chai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+subviral+particles+of+hepatitis+B+virus.">Properties of subviral particles of hepatitis B virus.</a> Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).</li><li>Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+interplay+between+uptake+transport+and+CYP3A4+induction+in+micropatterned+cocultured+hepatocytes.">Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).</li><li>Parvez, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+antiviral+drugs+as+novel+hepatitis+B+virus+inhibitors:+Cell+culture+and+molecular+docking+study.">Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).</li></ol>

HBV 감염은 간세포25 상의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPGs)에 대한 낮은 친화도 결합을 통해 시작되고, 이어서 엔도 사이토 시스26을 통한 후속 내재화와 함께 NTCP에 결합한다. NTCP는 HBV 진입에 중요한 수용체이기 때문에 HBV 진입을 표적으로 하는 것은 임상적으로 번역되어 de novo 감염, 모자 간 전염(MTCT) 및 간 이식 후 재발을 감소시킬 수 있습니다. ?...

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 생명을 위협하는 질병으로 간주됩니다. 만성 HBV 감염은 간경변 및 간세포 암종1의 위험이 있습니다. 현재의 항 HBV 치료는 주로 핵 (t) ide 유사체 (NA) 및 인터페론 알파 (IFN-α)2,3를 사용한 바이러스 후 진입에 중점을 둡니다. HBV 진입 억제제 인 Myrcludex B의 발견은 항 HBV 제제4에 대한 새로운 표적을 확인했습니다. 만성 HBV에서 진입 억제제와 NA의 조합은 바이러스복제 단독을 표적으로 하는 것에 비해 바이러스 부하를 유의하게 감소시켰습니다5,6. 그러나, HBV 진입 억제제의 스크리닝을위한 고전적인 간세포 모델은 낮은 바이러스 수용체 수준 (나트륨 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드, NTCP)에 의해 제한된다. 간암 세포(즉, HepG2 및 Huh7)에서 hNTCP의 과발현은 HBV 감염성을 개선합니다 7,8. 그럼에도 불구하고, 이들 세포주는 낮은 수준의 I 및 II 상 약물 대사 효소를 발현하고 유전 적 불안정성을 나타낸다9. 전바이러스 진입, NTCP 결합 및 바이러스 진입과 같은 후보 항-HBV 화합물의 뚜렷한 메커니즘을 표적으로 하는 데 도움이 될 수 있는 간세포 모델은 효과적인 조합 요법의 식별 및 개발을 촉진할 것입니다. 커큐민의 항 HBV 활성에 대한 연구는 바이러스 진입 중단 후 새로운 메커니즘으로서 바이러스 진입 억제를 해명했습니다. 이 프로토콜은 항-HBV 진입 분자10의 스크리닝을 위한 숙주 모델을 상세히 설명한다.
이 방법의 목표는 바이러스 진입 억제, 특히 NTCP 결합 및 수송 차단을 위한 후보 항-HBV 화합물을 탐색하는 것입니다. NTCP 발현은 HBV 진입 및 감염에 중요한 요소이므로 NTCP 수준11을 최대화하기 위해 간세포 성숙 프로토콜을 최적화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 HBV 진입에 대한 억제 효과를 HBV 부착의 억제 대 내재화의 억제로서 구별할 수 있다. 타우로 콜산 (TCA) 흡수 분석은 또한 NTCP 수송12,13을 나타 내기 위해 방사성 동위 원소 대신 ELISA 기반 방법을 사용하여 변형되었습니다. 수용체와 리간드 상호작용은 이들의 3D 구조14,15에 의해 확인되었다. NTCP 기능의 억제는 TCA 흡수 활성(16)을 측정함으로써 평가할 수 있다. 그러나, 이 기술은 후보 억제제에 대한 NTCP 결합의 직접적인 증거를 제공하지 않았다. 따라서, 결합은 다양한 기술, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(17), ELISA, 형광-기반 열 이동 분석(FTSA)18, FRET19, 알파스크린(AlphaScreen) 및 다양한 다른 방법(20)을 사용하여 조사될 수 있다. 이들 기술 중에서, ITC는 거의 모든 반응에서 열 흡수 또는 방출을 관찰할 수 있기 때문에 결합 분석의 목표 표준이다(21). NTCP와 후보 화합물의 결합 친화도(KD)는 ITC를 사용하여 직접 평가되었습니다. 이들 친화도 값은 In Silico 예측 모델22를 사용하여 수득된 값보다 더 정확하였다.
이 프로토콜은 간세포 성숙, HBV 감염 및 HBV 진입 억제제 스크리닝 기술을 다룹니다. 간단히 말해서, 간세포 모델은 imHC 및 HepaRG 세포주를 기반으로 개발되었습니다. 배양된 세포는 2주 이내에 성숙한 간세포로 분화되었다. NTCP 수준의 상향 조절은 real-time PCR, 웨스턴 블롯 및 유세포분석11을 사용하여 검출하였다. B형 간염 비리온(HBVcc)을 생산하고 HepG2.2.15로부터 수집하였다. 분화된 imHC 또는 HepaRG (d-imHC, d-HepaRG)를 HBV 비리온으로 접종하기 2시간 전에 항-HBV 후보로 예방적으로 처리하였다. 실험의 예상 결과는 세포 HBV와 감염성을 감소시키는 약제의 확인이었습니다. 항-NTCP 활성은 TCA 흡수 분석을 사용하여 평가하였다. NTCP 활동은 NTCP를 구체적으로 바인딩한 에이전트에 의해 억제될 수 있습니다. ITC 기술은 억제제 및 그의 표적 단백질을 예측할 수 있는 상호작용적 결합의 타당성을 조사하기 위해 사용되었고, 생체분자 복합체23,24의 비공유 상호작용을 통해 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도(KD)를 결정하였다. 예를 들어, KD≥ 1 × 103 mM은 약한 결합을 나타내고, KD≥ 1 ×10 6 μM은 중간 결합을 나타내고, KD≤ 1 × 109 nM은 강한 결합을 나타낸다. ΔG는 결합 상호 작용과 직접적인 상관 관계가 있습니다. 특히, 음성 ΔG와의 반응은 exergonic 반응이며, 이는 결합이 자발적인 과정임을 나타낸다. 음의 ΔH를 갖는 반응은 결합 과정이 수소 결합과 반 데르 발스 힘에 의존한다는 것을 나타낸다. TCA 섭취 및 ITC 데이터 모두 항 HBV 진입 제제를 선별하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 결과는 항 HBV 스크리닝뿐만 아니라 결합 친화도 및 수송 기능을 통해 평가되는 NTCP와의 상호 작용을위한 기초를 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 숙주 세포 준비 및 특성화, 실험 설계 및 NTCP 결합 친화도와 함께 항 -HBV 항목의 평가에 대해 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG Cells, Cryopreserved</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HPRGC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCC249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>FUJIFLIM Wako chemical</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>abcam</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G 418 disulfate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108321-42-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail&#160; EDTA-free (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-0500-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-0500-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImProm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara bio</td>
			<td>PT4421-2</td>
			<td>concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata crescendo Western HRP substrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WBLUR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix (2x) Universal</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin DNA extraction kit</td>
			<td>macherey-nagel</td>
			<td>1806/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant NTCP</td>
			<td>Cloud-Clone</td>
			<td>RPE421Hu02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>20-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>345909-26-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA Elisa kit</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MB2033685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dilute to 0.125%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Anti-NTCP1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131084</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM4300</td>
			<td>1:200,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205718</td>
			<td>1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; HRP goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td>1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176; Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 3% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Working concentration: 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>199931</td>
			<td>Working concentration: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; DME/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% Pen/Strep</td>
			<td>HyClon</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatic maturation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Williams&#8217; E medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4125-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% Pen/Strep</td>
			<td>HyClon</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/mL&#160; Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 &#181;M hydrocotisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 2% DMSO</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3672-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 3% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Working concentration: 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 0.2% Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Working concentration: 0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Na3VO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PMSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NaF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Final concentration: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; 2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Blocking solution/ 2&#176; Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 5% Skim milk (nonfat dry milk)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td>Working concentration: 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Running buffer 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>14.4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7910</td>
			<td>Working concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blot transfer buffer 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>7.2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106009</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mild stripping solution 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust pH to 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>15 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7910</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstream Class II</td>
			<td>Esco</td>
			<td>2010621</td>
			<td>Biological safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelCulture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>2170002</td>
			<td>Humidified tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes (10 mL)</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes (5 mL)</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCal PEAQ-ITC</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Isothermal titration calorimeters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-blot absorbent filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Lum G Imaging System</td>
			<td>Aplegen</td>
			<td>8418-10-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4430000.018</td>
			<td>Easypet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 A91:D106flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Semi-dry transfer cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)</td>
			<td>Sonics &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Esco</td>
			<td>T1000R</td>
			<td>Centrifuge with swinging bucket rotar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a competent hepatocyte model examining hepatitis b virus entry through sodium taurocholate cotransporting polypeptide as a therapeutic target

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간세포암의 중요한 위험 요소로 간주되어 왔습니다. 현재의 치료는 바이러스 부하를 줄일 수 있을 뿐 완전한 관해를 초래하지는 않습니다. HBV 감염에 대한 효율적인 간세포 모델은 치료제 스크리닝에 중요한 실제 바이러스 수명 주기를 제공할 것입니다. 대부분의 사용 가능한 항 HBV 제제는 바이러스 진입 후 수명주기 단계를 목표로하지만 바이러스 진입 전에는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 바이러스 진입 전 및 바이러스 진입 후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 치료제를 스크리닝할 수 있는 유능한 간세포 모델의 생성을 자세히 설명합니다. 여기에는 숙주 세포로서 imHC 또는 HepaRG를 기반으로 하는 나트륨 타우로콜레이트 공동 수송 폴리펩티드(NTCP) 결합, cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 조립의 표적화가 포함됩니다. 여기서, HBV 진입 억제 분석은 NTCP를 통한 HBV 결합 및 수송 기능을 억제하기 위해 커큐민을 사용하였다. 억제제는 열역학적 파라미터에 기초한 HBV 약물 스크리닝을 위한 범용 도구인 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 NTCP와의 결합 친화도(KD)에 대해 평가되었습니다.

특히 imHC의 분화 단계에서 이핵 세포와 다각형 형태 (그림 1)를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다 (그림 1A). NTCP 발현의 큰 증가는 d-HepaRG 및 d-imHC에서 각각 7배 및 40배로 측정되었습니다(그림 1B). HBV 진입에 대한 감수성을 부여하는 것으로 가정 된 NTCP의 고도로 글리코 실화 된 형태는 d-HepaRG보다 d-imHC에서 더 많이 검출되었다 (...

Watch this Scientific Journal Video about A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target at JoVE.com

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

이 프로토콜은 후보 항 HBV 화합물이 특히 NTCP 결합을 차단하여 바이러스 진입을 억제하는지 확인하도록 설계되었습니다. 이 기술은 HBV 진입 또는 감염의 초기 단계가 후보 화합물에 의해 중단 될 수 있는지 조사하기위한 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 PSP 학생 인 Piyanoot Thongsri가 될 것입니다.나트륨 타우로콜레이트 공동수송 폴리펩티드 또는 NTCP의 측정을 시작하려면, 성숙한 간세포를 8밀 이상의 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 EDTA와 함께 15분 동안 배양한다. 세포 펠릿을 수집하고 PBS에 3.7 % 파라 포름 알데히드 300 마이크로 리터를 15 분 동안 첨가하여 간세포를 고정합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 옮겨 300G 및 섭씨 25도에서 10 분 동안 원심 분리합니다.앞에서 설명한 대로 10분 동안 원심분리기에서 1% 소 태아 혈청 또는 FBS를 함유하는 700 마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척한다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 PBS 중 300마이크로리터의 0.05% Triton X 100으로 세포를 투과화합니다. 원심분리 후 1%FBS를 포함하는 700 마이크로리터의 PBS를 사용하여 각각 1분씩 3회 세척해 준다.세포를 섭씨 4도에서 1 대 100 비율로 NTCP에 대한 1차 항체와 함께 30분 동안 배양한 다음, 파마 세척 완충액으로 3회 세척하고, 원심분리한다. Alexa Fluor 488에 접합된 2차 항체로 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 염색하고 각각 1분 동안 파마 세척 완충액을 3회 세척을 반복합니다. 300G에서 원심분리한 후, 1%FBS를 함유하는 200마이크로리터의 PBS로 세포 펠릿을 재현탁시킨다.소프트웨어에서 FSC, SSC, FITC 또는 PE를 포함한 유세포 분석을 위한 측정 파라미터를 선택합니다. 자동 보정 조정을 설정하고 원고에 설명된 대로 보정 컨트롤을 포함합니다. 다음으로, 염색되지 않은 샘플을 분당 60 마이크로 리터의 중간 유체 유속으로 실행합니다. 전방 산란 및 측면 산란 임계값이 관심 있는 세포 집단을 덮을 때까지 조정합니다.이 영역의 게이트 영역을 표시하고 모든 보상 제어에 적용하십시오. 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 광 배율 튜브 또는 PMT 형광을 설정하고 음의 사분면에서 FITC 또는 PE의 PMT 전압을 조정합니다. 양성 염색 샘플을 실행하고 양성 사분면 척도에서 FITC 또는 PE를 조정합니다.염색되지 않은 FITC 염색 또는 PE 컨트롤을 실행하고 보정을 계산하여 샘플 설정에 적용합니다. 다음으로 간세포 샘플을 실행하여 NTCP 수준을 측정합니다. 다음으로, BD FACSuite 창, 컨트롤 튜브, 데이터 소스 탭을 순차적으로 선택하여 염색된 간세포 분석을 시작합니다.원시 데이터가 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 오른쪽의 워크 시트 탭에서 타원 게이트 버튼을 클릭하고 마우스 커서를 사용하여 셀 모집단과 SSC 및 FSC 점도표를 선택합니다. 그런 다음 원 P1이 나타날 때까지 기다리십시오.간격 게이트 버튼을 클릭하고 플루오레세인 이소티오시아네이트 염색 히스토그램에서 영역을 표시합니다. 가장 높은 형광 강도 값에서 오른쪽으로 시작합니다. P2 줄이 화면에 나타납니다.실험 튜브를 클릭하고 워크시트 탭의 데이터가 변경되는지 확인합니다. 통계 버튼을 클릭 한 다음 빈 공간과 워크 시트를 클릭하십시오. 이어서, 나트륨 타우로콜레이트 공동수송 폴리펩티드 집단의 통계적 값을 관찰한다.100% 합류 MHC 웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 윌리엄 E 배지로 희석한 4개의 마이크로몰 사이클로스포린 A를 2시간 동안 추가합니다. 다음으로, 후보 B 형 간염 바이러스 진입 억제제를 흡인하여 4 % 폴리에틸렌 글리콜을 함유 한 Williams E 배지 1 밀리리터로 대체합니다. 이어서, 배양 배지를 B형 간염 바이러스 입자와 함께 섭씨 37도에서 18시간 동안 웰당 100개의 감염 다중으로 배양한다.그런 다음 2ml의 차가운 PBS에서 상청액을 버리고 부드럽게 소용돌이 치면서 결합되지 않은 B 형 간염 바이러스로 오래된 배지를 헹굽니다. 세포를 2 밀리리터의 완전한 윌리엄 E 배지로 7 일 동안 배양 한 후 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 15 분 동안 3.7 % 파라 폼 알데히드 및 PBS로 고정시켰다. 감염된 세포를 1차 항체에서 실온에서 60분 동안 IF 차단 용액으로 순차적으로 배양하여 섭씨 4도에서 밤새 블로킹 용액에서 1 내지 200으로 희석한다.이어서 실온에서 1시간 동안 1 내지 500 희석하여 세포를 배양하기 전에 세척액을 이용하여 각각 1분씩 3회 세척해 준다. 세 번 세척한 후 DAPI가 있는 페이드 방지 장착 매체로 샘플을 장착하고 유리 커버 슬립으로 덮습니다. DAPI 및 PE 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 20 x 대물 렌즈로 형광 신호를 검출하여 후보 화합물의 항 HBV 진입 활성을 결정합니다.세포 결합 분석을 위해, 이전에 입증 된대로 세포를 준비하고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 B 형 간염 바이러스 입자와 함께 배양하십시오. 배지를 버린 후 부드러운 소용돌이로 차가운 PBS 2ml로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 감염된 세포를 수확하고 용해 완충액으로 세포를 파괴합니다.세포 용해물을 수집 튜브로 옮겨 원고에 설명된 온도 조건을 사용하여 중합효소 연쇄 반응으로 전체 DNA를 추출합니다. 앞에서 입증 된 바와 같이 세포를 준비한 후, 실온에서 15 분 동안 나트륨 타우로 콜산 용액으로 간세포를 배양하고, 용액을 흡인하고, 차가운 hepes로 세포를 세 번 세척한다. 다음으로, 300-500 마이크로 리터의 차가운 hepes를 추가하여 얼음 위의 세포 스크레이퍼로 세포를 수확합니다.20 초 동안 20 킬로 헤르츠에서 초음파로 세포를 균질화하고 5 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 10, 000 G에서 원심분리한 후, 상층액을 수집하고 타우로콜산 ELISA 분석 키트를 사용하여 세포내 타우로콜산 농도를 평가하였다. 등온 적정 열량계 또는 ITC 기기에서 세포와 주사기를 세척하려면 ITC 소프트웨어를 실행하십시오.실험 실행 강조 표시 탭에서 19 주입 도트 ITCM에 대한 마이크로 cal 방법을 선택하고 열기를 클릭합니다. 새 창이 열리면 청소 탭을 클릭하고 청소 방법 창에서 셀 세척 방법에 대한 세척 버튼과 주사기 세척 방법에 대한 헹굼 버튼을 선택합니다. 다음을 클릭하고 화면의 지시를 따릅니다.샘플을 ITC에 로드한 후 실험 실행 탭 아래에 있는 로드 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 다음을 클릭하고 이 로드 단계가 완료될 때까지 비디오 지침을 따릅니다. 주사기를 사용하여 샘플 셀의 용액 버퍼로 기준 셀을 버퍼에 15 마이크로 몰 NTCP로 채 웁니다.여분의 용액을 제거한 다음 기포를 피하면서 150 마이크로 몰 커큐민 리간드 용액으로 주사기를 채 웁니다. 실험 실행 탭 아래의 실행 단추를 클릭하여 샘플을 실행합니다. 실험 정보 및 설정이 왼쪽에 표시됩니다.리간드 단백질 농도와 온도 세부 정보를 입력합니다. 시작을 클릭하여 주입 프로세스를 수행합니다. 단백질 리간드 상호 작용이 완료 될 때까지 1.4 시간 동안 기다리십시오.주입이 완료되면 강조 표시된 분석 버튼을 선택하여 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 분석합니다. 그런 다음 개요를 클릭하여 원시 데이터를 표시하고 피팅 모델을 하나의 결합 사이트 세트로 선택합니다. 특히 MHC의 분화 단계에서 이핵 세포 및 다각형 모양의 형태를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다.분화된 HepaRG 및 분화된 MHC에서 NTCP 발현의 큰 증가가 관찰되었다. 고도로 글리코 실화 된 형태의 NTCP는 분화 된 HepaRG보다 분화 된 MHC에서 더 많이 검출되었습니다. NTCP 수준은 미분화 세포보다 분화된 MHC 세포에서 더 높았다.바이러스 면역형광염색은 감염 후 7일째에 항 HBV 진입 활성을 평가하고, 세포 표면 수용체에 대한 바이러스 결합 수준을 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 평가하였다. 타우로 콜산 섭취 분석은 후보 화합물의 징벌 적 억제 활성이 NTCP를 통한 B 형 간염 바이러스 결합을 감소 시킨다는 것을 시사했다. 비색 변화는 샘플 세포에 대한 연속 주입으로 감지되었습니다.표준 비선형 최소 제곱 회귀는 데이터에 잘 맞는 하나의 결합 부위를 기반으로 플롯되었습니다. 실선은 SBB 결합에 대한 실험값에 가장 적합하고 B형 간염 바이러스 입자가 섭씨 4도에서 배양되는 것을 나타내었다. 타우로 콜산 업데이트는 방사성 기술을 사용하여 평가할 수 있습니다.방사성 타우로 콜산의 수준은 액체 시뮬레이션 카운터를 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 이 기술은 감염 또는 재감염을 예방하는 데 도움이 되는 항바이러스 요법의 조사 활동에서 바이러스 항목을 간단하고 빠르게 선별합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

재조합 고세균 프로 테아과 비 변성 페이지로 프로 테아 조립 검사 : 케이스를 결합 접근에 대한

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...