Name: a competent hepatocyte model examining hepatitis b virus entry through sodium taurocholate cotransporting polypeptide as a therapeutic target
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target at JoVE.com

Este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad de Mahidol y la Investigación e Innovación Científica de Tailandia (TSRI) otorgados por separado a A. Wongkajornsilp y K. Sa-ngiamsuntorn. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Oficina del Consejo Nacional de Políticas de Investigación e Innovación en Ciencias de la Educación Superior a través de la Unidad de Gestión de Programas para la Competitividad (número de subvención C10F630093). A. Wongkajornsilp recibió una beca Chalermprakiat de la Facultad de Medicina del Hospital Siriraj de la Universidad de Mahidol. Los autores desean agradecer a la señorita Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Facultad de Ciencias, Universidad de Mahidol) por su ayuda con la técnica ITC.

NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en una campana de flujo de riesgo biológico de Clase II o en una campana de flujo laminar. El manejo del VHB fue aprobado éticamente por el IRB (MURA2020/1545). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todas las soluciones, reactivos, equipos y líneas celulares utilizadas en este protocolo.
1. Preparación de células huésped (hepatocitos maduros)
<ol><li>Cultivar hepatocitos (3,75 ?...

<ol>
	<li>Levrero, M., Zucman-Rossi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+HBV-induced+hepatocellular+carcinoma.">Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).</li><li>Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+anti-HBV+agents+and+their+resistance.">Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance.</a> Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).</li><li>Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+for+hepatitis+B:+New+treatment+options+necessitate+reappraisal+of+traditional+endpoints.">Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints.</a> Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).</li><li>Volz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entry+inhibitor+Myrcludex-B+efficiently+blocks+intrahepatic+virus+spreading+in+humanized+mice+previously+infected+with+hepatitis+B+virus.">The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus.</a> Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).</li><li>Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antivirals+in+clinical+development+for+chronic+hepatitis+B+infection.">Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection.</a> Viruses. 13 (6), 1169 (2021).</li><li>Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HBV+and+HDV:+New+Treatments+on+the+Horizon.">HBV and HDV: New Treatments on the Horizon.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+identification+of+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+using+HepG2+cells+overexpressing+a+membrane+transporter+NTCP.">Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).</li><li>Tong, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+NTCP+as+an+HBV+receptor:+the+beginning+of+the+end+or+the+end+of+the+beginning.">Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning.</a> Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).</li><li>Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+HepG2-derived+cells+expressing+cytochrome+P450s+for+assessing+metabolism-associated+drug-induced+liver+toxicity.">Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).</li><li>Thongsri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibited+hepatitis+B+viral+entry+through+NTCP+binding.">Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding.</a> Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).</li><li>Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+hepatocyte-like+cell+line+(imHC)+accommodated+complete+viral+lifecycle,+viral+persistence+form,+cccDNA+and+eventual+spreading+of+a+clinically-isolated+HBV.">An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV.</a> Viruses. 11 (10), 952 (2019).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).</li><li>Kaneko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tricyclic+polyketide,+Vanitaracin+A,+specifically+inhibits+the+entry+of+hepatitis+B+and+D+viruses+by+targeting+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide.">A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide.</a> Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).</li><li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products.">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay:+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies.">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycosylation+of+the+Na+-taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP)+determines+its+trafficking+and+stability+and+is+required+for+hepatitis+B+virus+infection.">N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection.</a> PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).</li><li>Tsukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+hepatitis+B+and+D+virus+entry+inhibitors,+proanthocyanidin+and+its+analogs,+that+directly+act+on+the+viral+large+surface+proteins.">A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins.</a> Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).</li><li>Klumpp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+a+hepatitis+B+virus+replication+inhibitor+bound+to+the+viral+core+protein.">High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).</li><li>Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+inhibition+of+NTCP+by+myrcludex+B.">Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B.</a> JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).</li><li>Saso, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+identify+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+by+AlphaScreen+technology+targeting+the+envelope-receptor+interaction.">A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).</li><li>Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+characterization+of+recombinant+proteins.">Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+virtual+screening+protocol+for+in+silico+identification+of+potential+thyroid+disrupting+chemicals+targeting+transthyretin.">Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin.</a> Environmental Science &amp; Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).</li><li>Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+protein-ligand+interactions:+mechanisms,+models,+and+methods.">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).</li><li>Sureau, C., Salisse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+heparan+sulfate+binding+site+essential+to+infectivity+overlaps+with+the+conserved+hepatitis+B+virus+A-determinant.">A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant.</a> Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).</li><li>Herrscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+entry+into+HepG2-NTCP+cells+requires+clathrin-mediated+endocytosis.">Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis.</a> Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Mayati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarization+of+human+hepatoma+HepaRG+cells+in+response+to+forskolin.">Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).</li><li>Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).</li><li>Seeger, C., Mason, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium-dependent+taurocholic+cotransporting+polypeptide:+a+candidate+receptor+for+human+hepatitis+B+virus.">Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus.</a> Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).</li><li>Seeger, C., Sohn, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hepatitis+B+virus+with+CRISPR/Cas9.">Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).</li><li>Ni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+and+D+viruses+exploit+sodium+taurocholate+co-transporting+polypeptide+for+species-specific+entry+into+hepatocytes.">Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes.</a> Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).</li><li>Chai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+subviral+particles+of+hepatitis+B+virus.">Properties of subviral particles of hepatitis B virus.</a> Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).</li><li>Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+interplay+between+uptake+transport+and+CYP3A4+induction+in+micropatterned+cocultured+hepatocytes.">Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).</li><li>Parvez, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+antiviral+drugs+as+novel+hepatitis+B+virus+inhibitors:+Cell+culture+and+molecular+docking+study.">Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).</li></ol>

La infección por VHB se inicia a través de la unión de baja afinidad a proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en los hepatocitos25, seguida de la unión a NTCP con posterior internalización a través de endocitosis26. Como el NTCP es un receptor crucial para la entrada del VHB, la entrada dirigida al VHB puede traducirse clínicamente para disminuir la infección de novo , la transmisión maternoinfantil (MTCT) y la recurrencia después del trasplante de hí...

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se considera una enfermedad potencialmente mortal en todo el mundo. La infección crónica por VHB está cargada de riesgo de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular1. El tratamiento actual contra el VHB se centra principalmente en la entrada después de la viral utilizando análogos de nucleólidos (NA) e interferón-alfa (IFN-α)2,3. El descubrimiento de un inhibidor de la entrada del VHB, Myrcludex B, ha identificado un nuevo objetivo para los agentes anti-VHB4. La combinación de inhibidores de entrada y NAs en el VHB crónico ha disminuido significativamente la carga viral en comparación con aquellos dirigidos a la replicación viral sola 5,6. Sin embargo, el modelo clásico de hepatocitos para el cribado de los inhibidores de la entrada al VHB está limitado por los bajos niveles de receptores virales (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, NTCP). La sobreexpresión de hNTCP en células hepatomas (es decir, HepG2 y Huh7) mejora la infectividad del VHB 7,8. Sin embargo, estas líneas celulares expresan bajos niveles de enzimas metabolizadoras de fármacos de fase I y II y exhiben inestabilidad genética9. Los modelos de hepatocitos que pueden ayudar a atacar distintos mecanismos de compuestos candidatos contra el VHB, como la entrada previral, la unión a NTCP y la entrada viral, acelerarían la identificación y el desarrollo de regímenes de combinación eficaces. El estudio de la actividad anti-VHB de la curcumina ha dilucidado la inhibición de la entrada viral como un nuevo mecanismo además de la interrupción posterior a la entrada viral. Este protocolo detalla un modelo de huésped para el cribado de moléculas de entrada anti-VHB10.
El objetivo de este método es explorar compuestos candidatos anti-VHB para la inhibición de la entrada viral, especialmente bloqueando la unión y el transporte de NTCP. Como la expresión de NTCP es un factor crítico para la entrada e infección del VHB, optimizamos el protocolo de maduración de hepatocitos para maximizar los niveles de NTCP11. Además, este protocolo puede diferenciar el efecto inhibitorio sobre la entrada del VHB como inhibición de la unión al VHB versus inhibición de la internalización. El ensayo de captación de ácido taurocólico (TCA) también se modificó utilizando un método basado en ELISA en lugar de un radioisótopo para representar el transporte NTCP12,13. La interacción receptor y ligando fue confirmada por sus estructuras 3D14,15. La inhibición de la función NTCP puede ser evaluada midiendo la actividad de captación de TCA16. Sin embargo, esta técnica no proporcionó evidencia directa de unión de NTCP a los inhibidores candidatos. Por lo tanto, la unión puede investigarse utilizando diversas técnicas, como la resonancia de plasmones de superficie17, ELISA, ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen y varios otros métodos20. Entre estas técnicas, el ITC es un estándar objetivo en el análisis de unión porque puede observar la absorción o emisión de calor en casi todas las reacciones21. La afinidad de unión (KD) de NTCP y compuestos candidatos se evaluó directamente mediante ITC; Esos valores de afinidad fueron más precisos que los obtenidos utilizando el modelo de predicción in silico 22.
Este protocolo cubre técnicas de maduración de hepatocitos, infección por VHB y detección de inhibidores de la entrada de VHB. Brevemente, se desarrolló un modelo de hepatocitos basado en líneas celulares imHC y HepaRG. Las células cultivadas se diferenciaron en hepatocitos maduros en 2 semanas. La regulación positiva de los niveles de NTCP se detectó mediante PCR en tiempo real, western blot y citometría de flujo11. El virión de la hepatitis B (VHBcc) se produjo y recolectó de HepG2.2.15. El imHC o HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) fue tratado profilácticamente con los candidatos anti-VHB 2 h antes de la inoculación con virión VHB. El resultado esperado del experimento fue la identificación de los agentes que disminuyen el VHB celular y la infectividad. La actividad anti-NTCP se evaluó mediante el ensayo de captación de TCA. La actividad de NTCP podría ser suprimida por los agentes que se unieron específicamente a NTCP. La técnica ITC fue empleada para investigar la factibilidad de la unión interactiva que podría predecir inhibidores y sus proteínas diana, determinando la afinidad de unión (KD) del ligando para el receptor a través de interacciones no covalentes del complejo biomolecular23,24. Por ejemplo, K D ≥ 1 × 103 mM representa una unión débil, K D ≥ 1 × 106 μM representa una unión moderada y K D ≤ 1 × 109 nM representa una unión fuerte. El ΔG está directamente correlacionado con las interacciones de unión. En particular, una reacción con ΔG negativo es una reacción exergónica, lo que indica que la unión es un proceso espontáneo. Una reacción con un ΔH negativo indica que los procesos de unión dependen del enlace de hidrógeno y de las fuerzas de Van der Waals. Tanto la captación de TCA como los datos del ITC podrían utilizarse para detectar agentes de entrada anti-VHB. Los resultados de estos protocolos pueden proporcionar una base no solo para la detección contra el VHB, sino también para la interacción con NTCP evaluada a través de la afinidad vinculante y la función de transporte. Este documento describe la preparación y caracterización de la célula huésped, el diseño experimental y la evaluación de la entrada anti-VHB junto con la afinidad de unión a NTCP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG Cells, Cryopreserved</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HPRGC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCC249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>FUJIFLIM Wako chemical</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>abcam</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G 418 disulfate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108321-42-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail&#160; EDTA-free (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-0500-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-0500-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImProm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara bio</td>
			<td>PT4421-2</td>
			<td>concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata crescendo Western HRP substrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WBLUR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix (2x) Universal</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin DNA extraction kit</td>
			<td>macherey-nagel</td>
			<td>1806/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant NTCP</td>
			<td>Cloud-Clone</td>
			<td>RPE421Hu02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>20-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>345909-26-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA Elisa kit</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MB2033685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dilute to 0.125%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Anti-NTCP1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131084</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM4300</td>
			<td>1:200,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205718</td>
			<td>1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; HRP goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td>1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176; Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 3% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Working concentration: 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>199931</td>
			<td>Working concentration: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; DME/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% Pen/Strep</td>
			<td>HyClon</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatic maturation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Williams&#8217; E medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4125-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% Pen/Strep</td>
			<td>HyClon</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/mL&#160; Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 &#181;M hydrocotisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 2% DMSO</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3672-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 3% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Working concentration: 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 0.2% Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Working concentration: 0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Na3VO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PMSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NaF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Final concentration: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; 2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Blocking solution/ 2&#176; Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 5% Skim milk (nonfat dry milk)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td>Working concentration: 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Running buffer 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>14.4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7910</td>
			<td>Working concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blot transfer buffer 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>7.2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106009</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mild stripping solution 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust pH to 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>15 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7910</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstream Class II</td>
			<td>Esco</td>
			<td>2010621</td>
			<td>Biological safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelCulture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>2170002</td>
			<td>Humidified tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes (10 mL)</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes (5 mL)</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCal PEAQ-ITC</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Isothermal titration calorimeters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-blot absorbent filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Lum G Imaging System</td>
			<td>Aplegen</td>
			<td>8418-10-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4430000.018</td>
			<td>Easypet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 A91:D106flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Semi-dry transfer cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)</td>
			<td>Sonics &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Esco</td>
			<td>T1000R</td>
			<td>Centrifuge with swinging bucket rotar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a competent hepatocyte model examining hepatitis b virus entry through sodium taurocholate cotransporting polypeptide as a therapeutic target

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se ha considerado un factor de riesgo crucial para el carcinoma hepatocelular. El tratamiento actual solo puede disminuir la carga viral, pero no puede dar lugar a una remisión completa. Un modelo de hepatocitos eficiente para la infección por VHB ofrecería un ciclo de vida viral fiel a la vida que sería crucial para la detección de agentes terapéuticos. La mayoría de los agentes anti-VHB disponibles se dirigen a las etapas del ciclo de vida después de la entrada viral, pero no antes de la entrada viral. Este protocolo detalla la generación de un modelo de hepatocitos competente capaz de detectar agentes terapéuticos dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada previral y posterior a la entrada viral. Esto incluye la orientación de la unión del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP), la formación de cccDNA, la transcripción y el ensamblaje viral basado en imHC o HepaRG como células huésped. Aquí, el ensayo de inhibición de entrada del VHB utilizó curcumina para inhibir las funciones de unión y transporte del VHB a través de NTCP. Los inhibidores se evaluaron para determinar la afinidad de unión (KD) con NTCP utilizando calorimetría de titulación isotérmica (ITC), una herramienta universal para la detección de fármacos contra el VHB basada en parámetros termodinámicos.

Se observaron características de maduración hepática, incluyendo células binucleadas y morfología de forma poligonal (Figura 1), especialmente en la etapa diferenciada de imHC (Figura 1A). Se midió un gran aumento en la expresión de NTCP en d-HepaRG y d-imHC a 7 veces y 40 veces, respectivamente (Figura 1B). La forma altamente glicosilada de NTCP, postulada para conferir susceptibilidad a la entrada de VHB, se detectó más e...

Watch this Scientific Journal Video about A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target at JoVE.com

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Presentamos un protocolo para detectar compuestos contra el virus de la hepatitis B (VHB) dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada pre y post-viral, utilizando calorimetría de titulación isotérmica para medir la afinidad de unión (KD) con el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio del huésped. La eficacia antiviral se determinó a través de la supresión de los marcadores del ciclo de vida viral (formación de ADNcc, transcripción y ensamblaje viral).

Un modelo competente de hepatocitos que examina la entrada del virus de la hepatitis B a través del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio como objetivo terapéutico

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

Este protocolo está diseñado para verificar si un compuesto candidato contra el VHB inhibe la entrada viral, especialmente mediante el bloqueo de la unión a NTCP. Esta técnica está destinada a investigar si la entrada del VHB o un paso inicial de infección podría ser interrumpido por cualquier compuesto candidato. Demostrando el procedimiento estará Piyanoot Thongsri, un estudiante de PSP de mi laboratorio.Para comenzar la medición del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, o NTCP, incubar los hepatocitos maduros con ocho molinos o más de ácido etilendiaminotetraacético o EDTA durante 15 minutos. Recoja los gránulos celulares y fije los hepatocitos agregando 300 microlitros de paraformaldehído al 3,7% en PBS durante 15 minutos. Luego transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para centrifugarlos a 300 G y 25 grados centígrados durante 10 minutos.Lave las células dos veces usando 700 microlitros de PBS que contienen 1% de suero bovino fetal o FBS en centrífuga durante 10 minutos como se describió anteriormente. Luego permeabilizar las células con 300 microlitros de 0.05% Triton X 100 en PBS a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la centrifugación dar tres lavados de un minuto cada uno utilizando 700 microlitros de PBS que contienen 1% FBS.Incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con el anticuerpo primario contra NTCP en una proporción de uno a 100, seguido de tres lavados con tampón de lavado permanente y centrifugación. Tiñe las células con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y repite tres lavados de tampón de lavado permanente durante un minuto cada uno. Después de la centrifugación a 300 G, resuspender el pellet celular con 200 microlitros de PBS que contengan 1% de FBS.En el software, seleccione los parámetros de medición para el análisis citométrico de flujo, incluidos FSC, SSC, FITC o PE. Establezca el ajuste de compensación automática e incluya los controles de compensación como se explica en el manuscrito. A continuación, ejecute la muestra sin teñir con un caudal fluídico medio de 60 microlitros por minuto. Ajuste el umbral de dispersión directa y lateral hasta que cubran la población de celdas de interés.Marque la región de la puerta en esta área y aplíquela a todos los controles de compensación. Ajuste el tubo multiplicador de fotos o la fluorescencia PMT utilizando el control sin teñir y ajuste el voltaje PMT de FITC o PE en el cuadrante negativo. Ejecute la muestra teñida positiva y ajuste FITC o PE en la escala del cuadrante positivo.Ejecute los controles sin teñir, teñidos FITC o PE, calcule la compensación y aplíquela a la configuración de la muestra. A continuación, ejecute la muestra de hepatocitos para medir el nivel de NTCP. A continuación, comience a analizar los hepatocitos teñidos seleccionando en serie en las ventanas de BD FACSuite, el tubo de control y luego la pestaña de fuentes de datos.Espere a que aparezcan los datos sin procesar. A continuación, en la pestaña de la hoja de trabajo en el lado derecho, haga clic en el botón de puerta de elipse, seleccione la población de celdas y SSC y el diagrama de puntos FSC usando el cursor del mouse. A continuación, espere a que aparezca el círculo P1.Haga clic en el botón de puerta de intervalo y marque la región en el histograma teñido de isotiocianato de fluoresceína. Comenzando desde el valor de intensidad de fluorescencia más alto hacia el lado derecho. La línea P2 aparece en la pantalla.Haga clic en el tubo de experimento y observe que los datos en la pestaña de la hoja de trabajo cambian. Haga clic en el botón de estadísticas y luego en el espacio vacío y la hoja de trabajo. Luego, observe los valores estadísticos de la población de polipéptidos cotransportadores de taurocolato de sodio.Aspirar el medio de las placas de pocillos MHC 100% confluentes y añadir cuatro ciclosporina A micromolar diluida con medio E de William durante dos horas. A continuación, aspire el candidato inhibidor de entrada del virus de la hepatitis B para reemplazarlo con un mililitro de Williams E Medium que contenga 4% de polietilenglicol. Luego, incubar el medio de cultivo con partículas del virus de la hepatitis B a una multiplicidad de infección de 100 por pocillo durante 18 horas a 37 grados centígrados.Luego, deseche el sobrenadante a dos mililitros de PBS frío y agite suavemente para enjuagar el medio viejo con el virus de la hepatitis B no unido. Después de cultivar las células con dos mililitros de medio E de William completo durante siete días, lave las células con PBS y fíjelas con aldehído paraformado al 3,7% y PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Incubar secuencialmente las células infectadas con solución bloqueadora de FI durante 60 minutos a temperatura ambiente en el anticuerpo primario a una dilución de uno a 200 en la solución de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados.Luego dé tres lavados de un minuto cada uno usando solución de lavado antes de incubar las células con el anticuerpo secundario en una dilución de uno a 500 durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces, monte la muestra con un medio de montaje anti decoloración con DAPI y cúbrala con un cubrero de vidrio. Usando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros DAPI y PE detecta la señal de fluorescencia con una lente objetivo 20 x para determinar la actividad de entrada anti HBV de los compuestos candidatos.Para el ensayo de unión celular, prepare las células como se demostró antes e incubarlas con partículas del virus de la hepatitis B a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después de desechar el medio, enjuague las celdas con dos mililitros de PBS frío con un suave remolino. Luego cosecha las células infectadas usando un raspador celular e interrumpe las células con tampón de lisis.Transfiera el lisado celular a un tubo de recolección para extraer el ADN total con reacción en cadena de la polimerasa utilizando las condiciones de temperatura descritas en el manuscrito. Después de preparar las células como se demostró anteriormente, incubar los hepatocitos con la solución de ácido taurocólico sódico durante 15 minutos a temperatura ambiente, aspirar la solución y lavar las células tres veces con HEPES fríos. A continuación, agregue de 300 a 500 microlitros de HEPES frío para cosechar las células con raspadores de células en hielo.Homogeneizar las células por ultrasonido a 20 kilohercios durante 20 segundos e incubar en hielo durante cinco minutos. Después de la centrifugación a 10, 000 G, recoger el sobrenadante y evaluar la concentración intracelular de ácido taurocólico utilizando un kit de ensayo ELISA de ácido taurocólico. Para lavar las células y la jeringa en la calorimetría de titulación isotérmica o instrumento ITC, inicie el software ITC.En la pestaña de resaltado ejecutar experimento, seleccione el método micro cal para ITCM de 19 puntos de inyección y haga clic en abrir. Cuando se abra una nueva ventana, haga clic en la pestaña de limpieza y en la ventana del método de limpieza seleccione el botón de lavado para el método de limpieza de celdas y el botón de enjuague para el método de limpieza de jeringas. Haga clic en siguiente y siga las instrucciones en pantalla.Después de cargar la muestra en el ITC, haga clic en el botón de carga presente en la pestaña ejecutar experimento. Luego haga clic en siguiente y siga las instrucciones del video hasta que se complete este paso de carga. Con una jeringa, llene la celda de referencia con tampón de solución en la celda de muestra con 15 NTCP micromolares en el tampón.Retire el exceso de solución, luego llene la jeringa con una solución de ligando de curcumina micromolar 150, evitando burbujas de aire. Ejecute el ejemplo haciendo clic en el botón Ejecutar en la pestaña Ejecutar experimento. La información experimental y la configuración se mostrarán en el lado izquierdo.Introduzca las concentraciones de proteína del ligando y los detalles de temperatura. Haga clic en iniciar para realizar el proceso de inyección. Espere 1,4 horas para que se complete la interacción del ligando proteico.Una vez completada la inyección, seleccione el botón de análisis resaltado para analizar los datos sin procesar utilizando el software de análisis. Luego, haga clic en descripción general para mostrar los datos sin procesar y elija el modelo de ajuste como un conjunto de sitio de enlace. Se observaron características de maduración hepática incluyendo células binucleadas y morfología de forma poligonal, especialmente en la etapa diferenciada del MHC.Se observó un gran aumento en la expresión de NTCP en HepaRG diferenciado y MHC diferenciado. La forma altamente glicosilada de NTCP se detectó más en MHC diferenciado que en HepaRG diferenciada. Los niveles de NTCP fueron más altos en las células MHC diferenciadas que en las células indiferenciadas.La tinción de inmunofluorescencia del virus evaluó las actividades de entrada anti VHB en el séptimo día después de la infección y el nivel de unión del virus en el receptor de la superficie celular se evaluó mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. El análisis de captación de ácido taurocólico sugirió que la actividad inhibitoria punitiva de los compuestos candidatos disminuyó la unión del virus de la hepatitis B a través de NTCP. La alteración colorimétrica se detectó con inyecciones continuas en la célula de muestra.Se trazó una regresión estándar no lineal de mínimos cuadrados basada en un sitio de unión bien ajustado a los datos. La línea continua indicó el mejor ajuste a los valores experimentales para la unión de SBB como a y que las células y la partícula viral de la hepatitis B se incuban a cuatro grados centígrados. La actualización de ácido taurocólico se puede evaluar mediante la técnica radiactiva.El nivel de ácido taurocólico radiactivo se puede cuantificar utilizando un contador de simulación líquida. Esta técnica es simple y rápida de detectar la entrada viral en la actividad de investigación de cualquier régimen antiviral que ayudaría a prevenir la infección o la reinfección.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Investigación

Bioquímica

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetría diferencial de barrido - un método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación del antígeno proteico

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Valoración de ELISA como método para determinar la constante de disociación de la interacción del ligando del Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...