Name: a competent hepatocyte model examining hepatitis b virus entry through sodium taurocholate cotransporting polypeptide as a therapeutic target
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target at JoVE.com

Bu araştırma projesi, Mahidol Üniversitesi ve Tayland Bilim Araştırma ve İnovasyon (TSRI) tarafından ayrı ayrı A. Wongkajornsilp ve K. Sa-ngiamsuntorn'a verilen desteklenmektedir. Bu çalışma, Ulusal Yüksek Öğretim Bilim Araştırma ve İnovasyon Politikası Konseyi Ofisi tarafından Rekabet Edebilirlik Program Yönetim Birimi (hibe numarası C10F630093) aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir. A. Wongkajornsilp Mahidol Üniversitesi Siriraj Hastanesi Tıp Fakültesi Chalermprakiat hibesi sahibidir. Yazarlar, ITC tekniğindeki yardımları için Bayan Sawinee Seemakhan'a (Mahidol Üniversitesi Fen Fakültesi, İlaç Keşfi Mükemmel Merkezi) teşekkür eder.

NOT: Aşağıdaki prosedürler Sınıf II biyolojik tehlike akış davlumbazında veya laminer akışlı davlumbazda gerçekleştirilmelidir. HBV'nin kullanımı IRB (MURA2020/1545) tarafından etik olarak onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm çözümler, reaktifler, ekipman ve hücre hatları hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Konakçı hücrelerin hazırlanması (olgun hepatositler)
<ol><li>Kültür hepatositleri (3.75 ?...

<ol>
	<li>Levrero, M., Zucman-Rossi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+HBV-induced+hepatocellular+carcinoma.">Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).</li><li>Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+anti-HBV+agents+and+their+resistance.">Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance.</a> Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).</li><li>Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+for+hepatitis+B:+New+treatment+options+necessitate+reappraisal+of+traditional+endpoints.">Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints.</a> Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).</li><li>Volz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entry+inhibitor+Myrcludex-B+efficiently+blocks+intrahepatic+virus+spreading+in+humanized+mice+previously+infected+with+hepatitis+B+virus.">The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus.</a> Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).</li><li>Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antivirals+in+clinical+development+for+chronic+hepatitis+B+infection.">Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection.</a> Viruses. 13 (6), 1169 (2021).</li><li>Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HBV+and+HDV:+New+Treatments+on+the+Horizon.">HBV and HDV: New Treatments on the Horizon.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+identification+of+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+using+HepG2+cells+overexpressing+a+membrane+transporter+NTCP.">Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).</li><li>Tong, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+NTCP+as+an+HBV+receptor:+the+beginning+of+the+end+or+the+end+of+the+beginning.">Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning.</a> Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).</li><li>Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+HepG2-derived+cells+expressing+cytochrome+P450s+for+assessing+metabolism-associated+drug-induced+liver+toxicity.">Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).</li><li>Thongsri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibited+hepatitis+B+viral+entry+through+NTCP+binding.">Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding.</a> Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).</li><li>Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+hepatocyte-like+cell+line+(imHC)+accommodated+complete+viral+lifecycle,+viral+persistence+form,+cccDNA+and+eventual+spreading+of+a+clinically-isolated+HBV.">An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV.</a> Viruses. 11 (10), 952 (2019).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).</li><li>Kaneko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tricyclic+polyketide,+Vanitaracin+A,+specifically+inhibits+the+entry+of+hepatitis+B+and+D+viruses+by+targeting+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide.">A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide.</a> Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).</li><li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products.">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li><li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay:+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies.">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li><li>Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycosylation+of+the+Na+-taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP)+determines+its+trafficking+and+stability+and+is+required+for+hepatitis+B+virus+infection.">N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection.</a> PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).</li><li>Tsukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+hepatitis+B+and+D+virus+entry+inhibitors,+proanthocyanidin+and+its+analogs,+that+directly+act+on+the+viral+large+surface+proteins.">A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins.</a> Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).</li><li>Klumpp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+a+hepatitis+B+virus+replication+inhibitor+bound+to+the+viral+core+protein.">High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).</li><li>Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+inhibition+of+NTCP+by+myrcludex+B.">Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B.</a> JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).</li><li>Saso, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+identify+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+by+AlphaScreen+technology+targeting+the+envelope-receptor+interaction.">A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).</li><li>Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+characterization+of+recombinant+proteins.">Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+virtual+screening+protocol+for+in+silico+identification+of+potential+thyroid+disrupting+chemicals+targeting+transthyretin.">Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin.</a> Environmental Science &amp; Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).</li><li>Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+protein-ligand+interactions:+mechanisms,+models,+and+methods.">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).</li><li>Sureau, C., Salisse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+heparan+sulfate+binding+site+essential+to+infectivity+overlaps+with+the+conserved+hepatitis+B+virus+A-determinant.">A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant.</a> Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).</li><li>Herrscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+entry+into+HepG2-NTCP+cells+requires+clathrin-mediated+endocytosis.">Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis.</a> Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Mayati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarization+of+human+hepatoma+HepaRG+cells+in+response+to+forskolin.">Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).</li><li>Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).</li><li>Seeger, C., Mason, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium-dependent+taurocholic+cotransporting+polypeptide:+a+candidate+receptor+for+human+hepatitis+B+virus.">Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus.</a> Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).</li><li>Seeger, C., Sohn, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hepatitis+B+virus+with+CRISPR/Cas9.">Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).</li><li>Ni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+and+D+viruses+exploit+sodium+taurocholate+co-transporting+polypeptide+for+species-specific+entry+into+hepatocytes.">Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes.</a> Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).</li><li>Chai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+subviral+particles+of+hepatitis+B+virus.">Properties of subviral particles of hepatitis B virus.</a> Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).</li><li>Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+interplay+between+uptake+transport+and+CYP3A4+induction+in+micropatterned+cocultured+hepatocytes.">Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).</li><li>Parvez, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+antiviral+drugs+as+novel+hepatitis+B+virus+inhibitors:+Cell+culture+and+molecular+docking+study.">Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).</li></ol>

HBV enfeksiyonu, hepatositler25 üzerindeki heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) düşük afiniteli bağlanma ile başlatılır, ardından endositoz26 yoluyla daha sonra içselleştirme ile NTCP'ye bağlanır. NTCP, HBV girişi için çok önemli bir reseptör olduğundan, HBV girişini hedeflemek, de novo enfeksiyonu, anneden çocuğa bulaşmayı (MTCT) ve karaciğer nakli sonrası nüksünü azaltmak için klinik olarak çevrilebilir. Viral girişin kes...

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu tüm dünyada hayatı tehdit eden bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Kronik HBV enfeksiyonu karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinom riski taşır1. Mevcut anti-HBV tedavisi çoğunlukla nükleos(t)ide analogları (NA'lar) ve interferon-alfa (IFN-α)2,3 kullanılarak viral giriş sonrası çalışmalara odaklanmaktadır. Bir HBV giriş inhibitörü olan Myrcludex B'nin keşfi, anti-HBV ajanları4 için yeni bir hedef belirlemiştir. Kronik HBV'de giriş inhibitörleri ve NA'ların kombinasyonu, tek başına viral replikasyonu hedefleyenlere kıyasla viral yükü önemli ölçüde azaltmıştır 5,6. Bununla birlikte, HBV giriş inhibitörlerinin taranması için klasik hepatosit modeli, düşük viral reseptör seviyeleri (sodyum taurokolat kotransportan polipeptit, NTCP) ile sınırlıdır. Hepatoma hücrelerinde (yani, HepG2 ve Huh7) hNTCP'nin aşırı ekspresyonu, HBV enfeksiyonunu 7,8 geliştirir. Bununla birlikte, bu hücre hatları düşük faz I ve II ilaç metabolize edici enzimleri eksprese eder ve genetik instabilitesergiler 9. Previral giriş, NTCP bağlama ve viral giriş gibi aday anti-HBV bileşiklerinin farklı mekanizmalarını hedeflemeye yardımcı olabilecek hepatosit modelleri, etkili kombinasyon rejimlerinin tanımlanmasını ve geliştirilmesini hızlandıracaktır. Kurkuminin anti-HBV aktivitesi için yapılan çalışma, viral giriş kesintisine ek olarak yeni bir mekanizma olarak viral girişin inhibisyonunu aydınlatmıştır. Bu protokol, anti-HBV giriş molekülleri10'un taranması için bir konak modelini detaylandırır.
Bu yöntemin amacı, viral giriş inhibisyonu için aday anti-HBV bileşiklerini araştırmak, özellikle NTCP bağlanmasını ve taşınmasını engellemektir. NTCP ekspresyonu HBV girişi ve enfeksiyonu için kritik bir faktör olduğundan, NTCP seviyeleri11'i en üst düzeye çıkarmak için hepatosit olgunlaşma protokolünü optimize ettik. Ek olarak, bu protokol HBV girişi üzerindeki inhibitör etkiyi HBV ekinin inhibisyonu ve içselleştirmenin inhibisyonu olarak ayırt edebilir. Taurokolik asit (TCA) alım testi, NTCP transport12,13'ü temsil etmek için radyoizotop yerine ELISA bazlı bir yöntem kullanılarak da modifiye edildi. Reseptör ve ligand etkileşimi 3D yapıları14,15 ile doğrulandı. NTCP fonksiyonunun inhibisyonu, TCA alım aktivitesi16 ölçülerek değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu teknik, NTCP'nin aday inhibitörlere bağlandığına dair doğrudan kanıt sağlamamıştır. Bu nedenle, yüzey plazmon rezonansı17, ELISA, floresan bazlı termal kayma testi (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen ve diğer çeşitli yöntemler20 gibi çeşitli teknikler kullanılarak bağlanma araştırılabilir. Bu teknikler arasında ITC, bağlanma analizinde bir hedef standarttır, çünkü hemen hemen her reaksiyonda ısı emilimini veya emisyonu gözlemleyebilir21. NTCP ve aday bileşiklerin bağlanma afinitesi (KD) doğrudan ITC kullanılarak değerlendirildi; Bu afinite değerleri, in silico tahmin modeli22 kullanılarak elde edilenlerden daha kesindi.
Bu protokol hepatosit matürasyonu, HBV enfeksiyonu ve HBV giriş inhibitörü taramasındaki teknikleri kapsar. Kısaca imHC ve HepaRG hücre hatlarına dayalı bir hepatosit modeli geliştirilmiştir. Kültürlenmiş hücreler 2 hafta içinde olgun hepatositlere farklılaştırıldı. NTCP düzeylerinin yukarı regülasyonu gerçek zamanlı PCR, western blot ve flow sitometri11 kullanılarak tespit edildi. Hepatit B virion (HBVcc) HepG2.2.15'ten üretildi ve toplandı. Diferansiye imHC veya HepaRG (d-imHC, d-HepaRG), HBV virion ile aşılamadan 2 saat önce anti-HBV adayları ile profilaktik olarak tedavi edildi. Deneyin beklenen sonucu, hücresel HBV ve infektiviteyi azaltan ajanların tanımlanmasıydı. Anti-NTCP aktivitesi TCA alım testi kullanılarak değerlendirildi. NTCP etkinliği, NTCP'yi özel olarak bağlayan aracılar tarafından bastırılabilir. ITC tekniği, inhibitörleri ve hedef proteinlerini tahmin edebilen etkileşimli bağlanmanın fizibilitesini araştırmak, biyomoleküler kompleksin kovalent olmayan etkileşimleri yoluyla reseptör için ligandın bağlanma afinitesini (KD) belirlemek için kullanıldı23,24. Örneğin, K D ≥ 1 × 103 mM zayıf bağlanmayı, K D ≥ 1 × 106 μM orta derecede bağlanmayı ve K D ≤ 1 × 109 nM güçlü bağlanmayı temsil eder. ΔG, bağlanma etkileşimleri ile doğrudan ilişkilidir. Özellikle, negatif ΔG'li bir reaksiyon, bağlanmanın kendiliğinden bir süreç olduğunu gösteren ekzergonik bir reaksiyondur. Negatif bir ΔH ile reaksiyon, bağlanma işlemlerinin hidrojen bağlarına ve Van der Waals kuvvetlerine bağlı olduğunu gösterir. Hem TCA alımı hem de ITC verileri, anti-HBV giriş ajanlarını taramak için kullanılabilir. Bu protokollerin sonuçları sadece anti-HBV taraması için değil, aynı zamanda bağlanma afinitesi ve taşıma fonksiyonu ile değerlendirilen NTCP ile etkileşim için de bir temel sağlayabilir. Bu yazıda konakçı hücre hazırlığı ve karakterizasyonu, deneysel tasarım ve anti-HBV girişinin NTCP bağlanma afinitesi ile birlikte değerlendirilmesi anlatılmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG Cells, Cryopreserved</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HPRGC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCC249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>FUJIFLIM Wako chemical</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>abcam</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G 418 disulfate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108321-42-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail&#160; EDTA-free (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-0500-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-0500-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImProm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara bio</td>
			<td>PT4421-2</td>
			<td>concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata crescendo Western HRP substrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WBLUR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix (2x) Universal</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin DNA extraction kit</td>
			<td>macherey-nagel</td>
			<td>1806/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant NTCP</td>
			<td>Cloud-Clone</td>
			<td>RPE421Hu02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>20-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>345909-26-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA Elisa kit</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MB2033685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dilute to 0.125%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Anti-NTCP1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131084</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM4300</td>
			<td>1:200,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205718</td>
			<td>1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; HRP goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td>1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176; Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 3% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Working concentration: 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>199931</td>
			<td>Working concentration: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; DME/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% Pen/Strep</td>
			<td>HyClon</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatic maturation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Williams&#8217; E medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4125-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% Pen/Strep</td>
			<td>HyClon</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/mL&#160; Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 &#181;M hydrocotisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 2% DMSO</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3672-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 3% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Working concentration: 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 0.2% Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Working concentration: 0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Na3VO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PMSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NaF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Final concentration: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; 2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Blocking solution/ 2&#176; Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 1x TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; 5% Skim milk (nonfat dry milk)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td>Working concentration: 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Running buffer 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>14.4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7910</td>
			<td>Working concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blot transfer buffer 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6435</td>
			<td>Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>7.2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106009</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mild stripping solution 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust pH to 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>15 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7910</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstream Class II</td>
			<td>Esco</td>
			<td>2010621</td>
			<td>Biological safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelCulture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>2170002</td>
			<td>Humidified tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes (10 mL)</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes (5 mL)</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCal PEAQ-ITC</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Isothermal titration calorimeters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-blot absorbent filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Lum G Imaging System</td>
			<td>Aplegen</td>
			<td>8418-10-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4430000.018</td>
			<td>Easypet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 A91:D106flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Semi-dry transfer cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)</td>
			<td>Sonics &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Esco</td>
			<td>T1000R</td>
			<td>Centrifuge with swinging bucket rotar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a competent hepatocyte model examining hepatitis b virus entry through sodium taurocholate cotransporting polypeptide as a therapeutic target

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu hepatosellüler karsinom için çok önemli bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. Mevcut tedavi sadece viral yükü azaltabilir, ancak tam remisyon ile sonuçlanmaz. HBV enfeksiyonu için etkili bir hepatosit modeli, terapötik ajanların taranması için çok önemli olacak gerçek bir viral yaşam döngüsü sunacaktır. Mevcut anti-HBV ajanlarının çoğu, viral girişten sonraki yaşam döngüsü aşamalarını hedefler, ancak viral girişten önce değil. Bu protokol, viral giriş öncesi ve viral giriş sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen terapötik ajanları tarayabilen yetkin bir hepatosit modelinin oluşturulmasını detaylandırmaktadır. Bu, sodyum taurokolat kotransporting polipeptit (NTCP) bağlanmasının, cccDNA oluşumunun, transkripsiyonun ve konakçı hücreler olarak imHC veya HepaRG'ye dayalı viral montajın hedeflenmesini içerir. Burada, HBV giriş inhibisyon testi, HBV bağlama ve NTCP aracılığıyla taşıma işlevlerini inhibe etmek için kurkumin kullandı. İnhibitörler, termodinamik parametrelere dayalı HBV ilaç taraması için evrensel bir araç olan izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılarak NTCP ile bağlanma afinitesi (KD) açısından değerlendirildi.

Özellikle imHC'nin diferansiye aşamasında binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji (Şekil 1) dahil olmak üzere hepatik olgunlaşma özellikleri gözlenmiştir (Şekil 1A). NTCP ekspresyonunda büyük bir artış d-HepaRG ve d-imHC'de sırasıyla 7 kat ve 40 kat olarak ölçülmüştür (Şekil 1B). HBV girişine duyarlılık kazandırdığı varsayılan NTCP'nin yüksek glikozile formu, d-imHC'de d-HepaRG'ye göre da...

Watch this Scientific Journal Video about A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target at JoVE.com

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.

Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

Bu protokol, aday bir anti HBV bileşiğinin özellikle NTCP bağlanmasını bloke ederek viral girişi inhibe edip etmediğini doğrulamak için tasarlanmıştır. Bu teknik, HBV girişinin veya enfeksiyonun ilk adımının herhangi bir aday bileşik tarafından kesintiye uğrayıp uğramayacağını araştırmak için tasarlanmıştır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir PSP öğrencisi olan Piyanoot Thongsri olacak.Sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit veya NTCP'nin ölçümüne başlamak için, olgun hepatositleri sekiz değirmen veya daha fazla etilendiamintetraasetik asit veya EDTA ile 15 dakika boyunca inkübe edin. Hücre peletlerini toplayın ve 15 dakika boyunca PBS'ye 300 mikrolitre% 3.7 paraformaldehit ekleyerek hepatositleri sabitleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 300 G ve 25 santigrat derecede santrifüj yapmak için 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha önce açıklandığı gibi% 1 fetal sığır serumu veya FBS içeren 700 mikrolitre PBS kullanarak santrifüjde 10 dakika boyunca hücreleri iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri PBS'de 300 mikrolitre% 0.05 Triton X 100 ile oda sıcaklığında 20 dakika geçirgenleştirin. Santrifüjlemeden sonra,% 1 FBS içeren 700 mikrolitre PBS kullanarak her biri bir dakikalık üç yıkama yapın.Hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca NTCP'ye karşı birincil antikor ile bir ila 100 oranında inkübe edin, ardından perm yıkama tamponu ile üç yıkama ve santrifüjleme yapın. Alexa Fluor 488'e konjuge edilmiş ikincil bir antikoru olan hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sabitleyin ve her biri bir dakika boyunca üç kez perma yıkama tamponu yıkamasını tekrarlayın. 300 G'de santrifüjlemeden sonra, hücre peletini% 1 FBS içeren 200 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.Yazılımda, FSC, SSC, FITC veya PE dahil olmak üzere akış sitometrik analizi için ölçüm parametrelerini seçin. Otomatik kompanzasyon ayarını ayarlayın ve makalede açıklandığı gibi kompanzasyon kontrollerini dahil edin. Ardından, lekesiz numuneyi dakikada 60 mikrolitrelik orta akışkan akış hızıyla çalıştırın. İlgilenilen hücre popülasyonunu kapsayana kadar ileri saçılma ve yan saçılma eşiğini ayarlayın.Bu alandaki kapı bölgesini işaretleyin ve tüm ücret kontrollerine uygulayın. Lekesiz kontrolü kullanarak fotoğraf çarpan tüpünü veya PMT floresansını ayarlayın ve negatif kadrandaki FITC veya PE'nin PMT voltajını ayarlayın. Pozitif lekeli numuneyi çalıştırın ve pozitif kadran ölçeğinde FITC veya PE'yi ayarlayın.Lekesiz, FITC lekeli veya PE kontrollerini çalıştırın, telafiyi hesaplayın ve örnek ayarlara uygulayın. Ardından, NTCP seviyesini ölçmek için hepatosit örneğini çalıştırın. Ardından, BD FACSuite pencerelerinde, kontrol tüpünde ve ardından veri kaynakları sekmesinde seri olarak seçerek lekeli hepatositleri analiz etmeye başlayın.Ham verilerin görünmesini bekleyin. Ardından, sağ taraftaki çalışma sayfası sekmesinde elips kapısı düğmesine tıklayın, fare imlecini kullanarak hücre popülasyonunu ve SSC'yi ve FSC nokta grafiğini seçin. Ardından P1 çemberinin görünmesini bekleyin.Aralık kapısı düğmesine tıklayın ve floresein izotiyosiyanat lekeli histogramdaki bölgeyi işaretleyin. En yüksek floresan yoğunluk değerinden başlayarak sağ tarafa kadar. Ekranda P2 çizgisi görünür.Deneme tüpüne tıklayın ve çalışma sayfası sekmesindeki verilerin değiştiğini gözlemleyin. İstatistikler düğmesine ve ardından boş alana ve çalışma sayfasına tıklayın. Daha sonra, sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit popülasyonunun istatistiksel değerlerini gözlemleyin.Ortamı% 100 akıcı MHC kuyu plakalarından aspire edin ve iki saat boyunca William'ın E Medium ile seyreltilmiş dört mikromolar siklosporin A ekleyin. Daha sonra, aday hepatit B virüsü giriş inhibitörünü aspire ederek %4 polietilen glikol içeren bir mililitre Williams E Medium ile değiştirin. Daha sonra, kültür ortamını hepatit B virüsü parçacıkları ile 37 santigrat derecede 18 saat boyunca kuyu başına 100 enfeksiyon çokluğunda inkübe edin.Daha sonra, süpernatantı iki mililitre soğuk PBS'ye atın ve eski ortamı bağlanmamış hepatit B virüsü ile durulamak için hafifçe döndürün. Hücreleri yedi gün boyunca iki mililitre tam William E Medium ile kültüre ettikten sonra, hücreleri PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3.7 paraform aldehit ve PBS ile sabitleyin. Enfekte olmuş hücreleri, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca IF bloke edici çözelti ile sıralı olarak, birincil antikorda, bloke edici çözeltide bir ila 200 seyreltmede, gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bir ila 500 seyreltmede ikincil antikor ile inkübe etmeden önce yıkama çözeltisi kullanarak her biri bir dakikalık üç yıkama yapın. Üç kez yıkadıktan sonra, numuneyi DAPI ile solmaya karşı bir montaj ortamı ile monte edin ve bir cam kapak kayması ile örtün. DAPI ve PE filtrelerine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak, aday bileşiklerin anti HBV giriş aktivitesini belirlemek için floresan sinyalini 20 x objektif lens ile algılar.Hücre bağlama testi için, hücreleri daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve iki saat boyunca dört santigrat derecede hepatit B virüsü parçacıkları ile inkübe edin. Ortamı attıktan sonra, hücreleri iki mililitre soğuk PBS ile yumuşak bir girdap ile durulayın. Daha sonra enfekte olmuş hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve hücreleri lizis tamponu ile bozun.Makalede açıklanan sıcaklık koşullarını kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile toplam DNA'yı çıkarmak için hücre lizatını bir toplama tüpüne aktarın. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi hazırladıktan sonra, hepatositleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sodyum taurokolik asit çözeltisi ile inkübe edin, çözeltiyi aspire edin ve hücreleri soğuk HEPES ile üç kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri buz üzerinde hücre kazıyıcılarla hasat etmek için 300 ila 500 mikrolitre soğuk HEPES ekleyin.20 saniye boyunca 20 kilohertz'de ultrasonikasyon ile hücreleri homojenize edin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 10.000 G'de santrifüjlemeden sonra, süpernatantı toplayın ve bir taurokolik asit ELISA tahlil kiti kullanarak hücre içi taurokolik asit konsantrasyonunu değerlendirin. İzotermal titrasyon kalorimetrisinde veya ITC cihazında hücreleri ve şırıngayı yıkamak için ITC yazılımını başlatın.Denemeyi çalıştır vurgulama sekmesinin altında, 19 enjeksiyon noktası ITCM için mikro cal yöntemini seçin ve aç'ı tıklayın. Yeni bir pencere açıldığında, temizle sekmesine tıklayın ve temizleme yöntemi penceresinde hücre temizleme yöntemi için yıkama düğmesini ve şırınga temizleme yöntemi için durulama düğmesini seçin. İleri'ye tıklayın ve ekrandaki talimatları izleyin.Örneği ITC'ye yükledikten sonra, denemeyi çalıştır sekmesinin altında bulunan yükle düğmesine tıklayın. Ardından İleri'ye tıklayın ve bu yükleme adımı tamamlanana kadar video talimatlarını izleyin. Bir şırınga kullanarak, referans hücreyi numune hücresindeki çözelti tamponu ile tamponda 15 mikromolar NTCP ile doldurun.Fazla çözeltiyi çıkarın, ardından şırıngayı hava kabarcıklarından kaçınarak 150 Mikromolar Kurkumin Ligand çözeltisi ile doldurun. Denemeyi çalıştır sekmesinin altındaki çalıştır düğmesine tıklayarak örneği çalıştırın. Deneysel bilgiler ve ayarlar sol tarafta görüntülenecektir.Ligand proteini konsantrasyonlarını ve sıcaklık ayrıntılarını girin. Enjeksiyon işlemini gerçekleştirmek için Başlat'a tıklayın. Protein ligand etkileşiminin tamamlanması için 1.4 saat bekleyin.Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, analiz yazılımını kullanarak ham verileri analiz etmek için vurgulanan analiz düğmesini seçin. Ardından, ham verileri görüntülemek için genel bakış'a tıklayın ve uygun modeli bir bağlama sitesi kümesi olarak seçin. Özellikle MHK'nın diferansiye evresinde, binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji dahil olmak üzere hepatik olgunlaşma özellikleri gözlenmiştir.Diferansiye HepaRG ve diferansiye MHC'de NTCP ekspresyonunda büyük bir artış gözlendi. NTCP'nin yüksek glikozile formu, diferansiye MHC'de diferansiye HepaRG'ye göre daha fazla tespit edildi. NTCP düzeyleri farklılaşmış MHC hücrelerinde farklılaşmamış hücrelere göre daha yüksekti.Virüs immünofloresan boyaması, enfeksiyon sonrası yedinci günde anti HBV giriş aktivitelerini değerlendirdi ve hücre yüzey reseptörü üzerindeki virüs bağlanma seviyesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirildi. Taurokolik asit alım analizi, aday bileşiklerin cezalandırıcı inhibitör aktivitesinin NTCP yoluyla Hepatit B virüsü bağlanmasını azalttığını göstermiştir. Kolorimetrik değişiklik, numune hücresine sürekli enjeksiyonlarla tespit edildi.Standart bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonu, verilere iyi oturmuş bir bağlama bölgesine dayanarak çizildi. Katı çizgi, SBB bağlanmasının deneysel değerlerine en uygun olanı ve hücrelerin ve hepatit B viral parçacığının dört santigrat derecede inkübe edildiğini gösterdi. Torokolik asit güncellemesi radyoaktif teknik kullanılarak değerlendirilebilir.Radyoaktif taurokolik asit seviyesi bir sıvı simülasyon sayacı kullanılarak ölçülebilir. Bu teknik, enfeksiyonu veya yeniden enfeksiyonu önlemeye yardımcı olacak herhangi bir antiviral rejimin araştırma aktivitesinde viral giriş taraması için basit ve hızlıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...