Disse protokoller er designet til at forstå, hvordan menneskelige neutrofiler interagerer med og dræber bakterielle biofilm. Målet er bedre at forstå dette og at begrænse variationen fra analyse til analyse, idet man forstår, at der er iboende problemer med humane neutrofiler fra donor til donorvariation. De teknikker, der er anført her, er optimeret til at give brugerne mulighed for at udføre eksperimenter med minimal variabilitet, især med løst vedhæftede biofilm.
Derudover kan disse protokoller også tilpasses til at studere andre mikrober, der kan danne biofilm. Begynd med at opnå isolerede kolonier af Staphylococcus aureus fra en kryopræserveret bestand ved hjælp af en stribepladeteknik på en næringsrig agarplade, såsom tryptisk sojaagar. Overtræk individuelle brønde af en 96-brøndplade med 100 mikroliter PLL fortyndet i sterilt vand og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
Aspirer PLL-opløsningen aseptisk ved hjælp af en vakuumassisteret aspirationsfælde. Lad brøndene tørre natten over ved stuetemperatur. Forbered en overnatningskultur ved at inokulere en koloni af S.aureus i MEM-alfa suppleret med 2% glucose og inkuberet ved 37 grader Celsius i 16 til 18 timer ved 200 rotationer pr. Minut.
Fortynd natten over kultur ved at overføre 50 mikroliter til fem milliliter frisk MEM-alfa suppleret med 2% glucose. Derefter inkuberes det ved 37 grader Celsius ved 200 rotationer pr. Minut, indtil midten af logaritmisk fase er opnået. Brug MEM-alpha til at normalisere midtlogaritmisk kultur til en OD på 0,1.
Overfør 150 mikroliter normaliseret kultur til hver brønd i den PLL-behandlede 96-brøndplade. Inkuber pladen i et befugtet kammer ved 37 grader Celsius i 18 til 20 timer. Aspirer supernatanten for at fjerne planktoncellerne.
Vask forsigtigt den resterende biomasse med 150 mikroliter HBSS for at fjerne de ikke-vedhæftede celler. Gentag mindst to gange for at fjerne alle planktoncellerne. Tilsæt 100 mikroliter 20% normalt humant serum fortyndet i HBSS dråbevis til den vaskede biofilm og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter for at opsonisere biofilmen.
Sspire serumopløsningen og vask biofilmene dråbevis med 150 mikroliter HBSS. Aspirer HBSS og efterlader brønde med opsoniserede biofilm. Der tilsættes luminol til neutrofilerne, der er suspenderet igen i HBSS for at udgøre en endelig koncentration på fem mikromolære luminol.
Denne løsning er klar til brug for gruppe A og C.Tilsæt neutrofiler blandet med luminol til brøndene med opsoniserede biofilm. For gruppe D fremstilles 50 mikromolær luminolopløsning i HBSS i et separat rør uden neutrofiler, og tilsæt det til brønden, der indeholder biofilmen. Aliquot 350 mikroliter neutrofiler blandet med luminol og tilsæt PMA i en endelig koncentration på 500 nanogram pr. milliliter til blandingen.
For gruppe B tilsættes neutrofilerne fra denne blanding i brønde uden biofilm. Dette tjener som en positiv kontrol. Centrifuger pladen ved 270 RCF i 30 sekunder ved fire grader Celsius.
Sørg for, at pladelæseren er indstillet til 37 grader Celsius, luminescensen og kinetikken læses i 60 minutter med tre minutters intervaller. Placer pladen i pladelæseren for at måle ROS-produktion med neutrofiler i 60 minutter. Brug en fluorescerende stamme af S.aureus, såsom USA300, der udtrykker GFP for at lette mikroskopibilleddannelse.
Inkuber neutrofiler med 100 mikromolære BCD i 30 minutter i en vippe ved 37 grader Celsius med 5% atmosfærisk kuldioxid. Sørg for, at prøverne inkuberes i mørke, og begræns lyseksponeringen. For at vaske overskydende BCD centrifugeres neutrofiler ved 270 RCF i fem minutter og opsuges supernatanten.
Suspender neutrofilerne igen i frisk HBSS. Derefter tilsættes ethidium homodimer-1 til de BCD-farvede neutrofiler i en endelig koncentration på fire mikromolar for at overvåge neutrofil og bakteriel død. Vask biofilmen med HBSS og tilsæt 150 mikroliter neutrofiler til S.aureus biofilmen, der er dyrket i mikroslides.
Inkuber mikrogliderne i et befugtet kammer i 30 minutter. Antallet af bakterieceller vil være baseret på celletællingerne opnået fra 18-timers biofilmbelægning. Forestil dig den neutrofile biofilminteraktion ved hjælp af fluorescerende kanaler svarende til fluorescerende farvestoffer eller proteiners excitations- og emissionsbølgelængder.
Bakterievækstmedier minimerede levedygtigheden af neutrofiler til ca. 60% efter 30 minutters inkubationsperiode. Pattedyrcellekulturmedier påvirkede imidlertid ikke levedygtigheden af neutrofiler og kan også understøtte væksten af S.aureus biofilm. Neutrofiler behandlet med PMA anvendt som kontrol viste en øget ROS-produktion.
I mangel af biofilm viste neutrofiler behandlet med PMA robust ROS-produktion. I nærværelse af S.aureus biofilm faldt den samlede ROS-produktion af neutrofiler behandlet med PMA, mens neutrofiler i mangel af PMA udelukkende stolede på deres interaktion med biofilmen, hvilket yderligere reducerede ROS-produktionen. Widefield fluorescerende mikroskopi afslørede, at mange neutrofiler var lokaliseret til overfladen, mens nogle få var inden for S.aureus biofilm.
De fleste af S.aureus-cellerne, der interagerer med neutrofiler, var døde, mens nogle få forblev i live som bestemt af LIVE / DEAD-farvning. Ethidium homodimer-1-farvede biofilm afslørede en brøkdel af den døde S.aureus-population i biofilmen. Effekten af at vaske biofilm og neutrofiler efter 30 minutters inkubation for at fjerne ikke-klæbede neutrofiler afslørede, at omkring 33% af døde neutrofiler stadig var knyttet til biofilmen.
De protokoller, der er anført her, kan også bruges til yderligere at studere andre funktionaliteter af neutrofiler, såsom fagocytose og dannelse af neutrofile ekstracellulære fælder, når neutrofiler støder på biofilm.
