פרוטוקולים אלה נועדו להבין כיצד נויטרופילים אנושיים מתקשרים עם ביופילמים של חיידקים והורגים אותם. המטרה היא להבין זאת טוב יותר, ולהגביל את השונות מבדיקה לבדיקה, מתוך הבנה שיש בעיות אינהרנטיות עם נויטרופילים אנושיים מתורם לשונות. הטכניקות המפורטות כאן עברו אופטימיזציה כדי לאפשר למשתמשים לבצע ניסויים עם שונות מינימלית, במיוחד עם ביופילמים מחוברים באופן רופף.
בנוסף, פרוטוקולים אלה יכולים גם להיות מותאמים לחקר מיקרובים אחרים שיכולים ליצור ביופילמים. התחילו בהשגת מושבות מבודדות של סטפילוקוקוס אאורוס ממלאי קריו-פרוטקטור באמצעות טכניקת צלחת פסים על צלחת אגר עשירה בחומרים מזינים, כגון אגר סויה טריפטי. מצפים בארות בודדות של צלחת 96 באר עם 100 microliters של PLL מדולל במים סטריליים לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
שאפו את פתרון ה-PLL באופן אספטי באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום. תנו לבארות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. הכינו תרבית לילה על ידי חיסון מושבה של S.aureus ב-MEM-אלפא בתוספת 2% גלוקוז ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות ב-200 סיבובים לדקה.
דלל את התרבית בן לילה על-ידי העברת 50 מיקרוליטרים לחמישה מיליליטרים של MEM-אלפא טרי בתוספת 2% גלוקוז. לאחר מכן דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס ב 200 סיבובים לדקה עד שלב לוגריתמי באמצע מושגת. השתמש ב-MEM-alpha כדי לנרמל את התרבית הלוגריתמית האמצעית ל-OD של 0.1.
העבר 150 מיקרוליטרים של תרבית מנורמלת לכל באר של צלחת 96 באר שטופלה ב- PLL. לדגור את הצלחת בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 20 שעות. שאפו את הסופרנטנט כדי להסיר את התאים הפלנקטוניים.
שטפו בעדינות את הביומסה הנותרת עם 150 מיקרוליטרים של HBSS כדי להסיר את התאים הלא מחוברים. חזור לפחות פעמיים כדי להסיר את כל התאים הפלנקטוניים. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של סרום אנושי 20% רגיל המדולל ב-HBSS טיפה לביופילם השטוף, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפוך את הביופילם ליעיל.
שאפו את תמיסת הסרום ושטפו את הביופילמים עם 150 מיקרוליטרים של HBSS. שאפו את ה-HBSS, והותירו אחריהם בארות עם ביופילמים מאופרים. הוסיפו לומינול לנויטרופילים שהושעו מחדש ב-HBSS כדי ליצור ריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים לומינול.
פתרון זה מוכן לשימוש עבור קבוצות A ו- C.הוסף נויטרופילים מעורבבים עם לומינול לבארות עם ביופילמים opsonized. עבור קבוצה D, הכינו 50 תמיסת לומינול מיקרומולרית ב-HBSS בצינור נפרד ללא נויטרופילים, והוסיפו אותה לבאר המכילה את הביופילם. Aliquot 350 מיקרוליטר של נויטרופילים מעורבבים עם לומינול ומוסיפים PMA בריכוז סופי של 500 ננוגרם למיליליטר לתערובת.
עבור קבוצה B, הוסף את הנויטרופילים מתערובת זו לבארות ללא ביופילם. זה משמש שליטה חיובית. צנטריפוגה של הצלחת ב 270 RCF במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס.
ודא שקורא הצלחות מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס, הזוהר והקריאה הקינטית במשך 60 דקות במרווחים של שלוש דקות. הניחו את הצלחת בקורא הצלחות כדי למדוד את ייצור ה-ROS על ידי נויטרופילים למשך 60 דקות. השתמש בזן פלואורסצנטי של S.aureus, כגון USA300, המבטא GFP כדי להקל על הדמיית מיקרוסקופיה.
דגירה של נויטרופילים עם 100 מיקרומולר BCD במשך 30 דקות בנדנדה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני אטמוספרי. ודא שהדגימות דוגרות בחושך, והגבל את החשיפה לאור. כדי לשטוף עודפי BCD, צנטריפוגות נויטרופילים ב 270 RCF במשך חמש דקות, ולשאוף את supernatant.
השהה מחדש את הנויטרופילים ב- HBSS טרי. לאחר מכן הוסיפו אתידיום הומודימר-1 לנויטרופילים המוכתמים ב-BCD בריכוז סופי של ארבעה מיקרומולרים כדי לנטר נויטרופילים ומוות חיידקי. שטפו את הביופילם עם HBSS והוסיפו 150 מיקרוליטרים של נויטרופילים לביופילם S.aureus שגדל במיקרו-מפולות.
דגרו את המיקרו-מפולות בתא לח למשך 30 דקות. מספר תאי החיידקים יתבסס על ספירות התאים המתקבלות מציפוי הביופילם בן 18 השעות. דמיינו את אינטראקציית הביופילם של הנויטרופילים באמצעות תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לצבעים פלואורסצנטיים, או אורכי גל של עירור ופליטה של חלבונים.
מדיית גדילת חיידקים צמצמה את הכדאיות של נויטרופילים לכ-60% לאחר 30 דקות של תקופת הדגירה. עם זאת, מדיה של תרביות תאי יונקים לא השפיעה על הכדאיות של נויטרופילים, ויכולה גם לתמוך בצמיחה של ביופילמים מסוג S.aureus. נויטרופילים שטופלו ב-PMA המשמש כבקרה הראו ייצור מוגבר של ROS.
בהיעדר ביופילמים, נויטרופילים שטופלו ב-PMA הראו ייצור ROS חזק. בנוכחות ביופילם S.aureus, הייצור הכולל של ROS על ידי נויטרופילים שטופלו ב-PMA ירד, בעוד שבהיעדר PMA, נויטרופילים הסתמכו אך ורק על האינטראקציה שלהם עם הביופילם, מה שהפחית עוד יותר את ייצור ה-ROS. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של Widefield גילתה כי נויטרופילים רבים היו ממוקמים על פני השטח בעוד שמעטים היו בתוך הביופילמים של S.aureus.
רוב תאי ה-S.aureus שהיו בקשר עם נויטרופילים היו מתים, בעוד שכמה מהם נשארו בחיים כפי שנקבע על ידי צביעת LIVE/DEAD. ביופילמים מוכתמים באתידיום הומודימר-1 חשפו שבריר מאוכלוסיית ה-S.aureus המתה בתוך הביופילם. ההשפעה של שטיפת הביופילם והנויטרופילים לאחר 30 דקות של דגירה כדי להסיר נויטרופילים שאינם דבקים גילתה שכ-33% מהנויטרופילים המתים עדיין מחוברים לביופילם.
הפרוטוקולים המפורטים כאן יכולים לשמש גם כדי להמשיך ולחקור פונקציות אחרות של נויטרופילים, כגון פאגוציטוזה, ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות כאשר נויטרופילים נתקלים בביופילמים.
