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June 8th, 2022
DOI :
June 8th, 2022
•0:04
Introduction
0:54
Preparation of In Vitro Biofilm
2:34
Measurement of ROS Production by Neutrophils
4:14
Imaging the Biofilm-Neutrophil Interactions
5:31
Results: Assessing Neutrophils and Biofilms Interactions via Standardized In Vitro Assays
6:56
Conclusion
Transcript
ये प्रोटोकॉल यह समझने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं कि मानव न्यूट्रोफिल बैक्टीरियल बायोफिल्म के साथ कैसे बातचीत करते हैं और मारते हैं। लक्ष्य इसे बेहतर ढंग से समझना है, और परख से परख तक परिवर्तनशीलता को सीमित करना है, यह समझते हुए कि दाता से दाता भिन्नता तक मानव न्यूट्रोफिल के साथ अंतर्निहित मुद्दे हैं। यहां सूचीबद्ध तकनीकों को उपयोगकर्ताओं को न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ प्रयोग करने की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है, खासकर शिथिल रूप से संलग्न बायोफिल्म के साथ।
इसके अतिरिक्त, इन प्रोटोकॉल को अन्य रोगाणुओं का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है जो बायोफिल्म बना सकते हैं। पोषक तत्वों से भरपूर आगर प्लेट, जैसे ट्राइप्टिक सोया आगर पर स्ट्रीक प्लेट तकनीक का उपयोग करके क्रायोसंरक्षित स्टॉक से स्टेफिलोकोकस ऑरियस की अलग-अलग कॉलोनियों को प्राप्त करके शुरू करें। 100 माइक्रोलीटर पीएलएल के साथ 96-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं को बाँझ पानी में पतला करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
वैक्यूम-असिस्टेड एस्पिरेशन ट्रैप का उपयोग करके पीएलएल समाधान को एस्पिरेटेड करें। कुओं को कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें। एमईएम-अल्फा में एस.ऑरियस की एक कॉलोनी को 2% ग्लूकोज के साथ पूरक करके और 200 रोटेशन प्रति मिनट पर 16 से 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एक रात भर की संस्कृति तैयार करें।
2% ग्लूकोज के साथ पूरक ताजा एमईएम-अल्फा के पांच मिलीलीटर में 50 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करके रात भर की संस्कृति को पतला करें। फिर इसे 200 रोटेशन प्रति मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि मध्य-लघुगणकीय चरण प्राप्त न हो जाए। 0.1 के ओडी में मध्य-लघुगणकीय संस्कृति को सामान्य करने के लिए एमईएम-अल्फा का उपयोग करें।
पीएलएल-उपचारित 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सामान्यीकृत संस्कृति के 150 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। प्लेट को 18 से 20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड चैंबर में इनक्यूबेट करें। प्लवक कोशिकाओं को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए एचबीएसएस के 150 माइक्रोलीटर के साथ शेष बायोमास को धीरे से धोएं। सभी प्लवक कोशिकाओं को हटाने के लिए कम से कम दो बार दोहराएं। धुले हुए बायोफिल्म में एचबीएसएस ड्रॉपवाइज में पतला 20% सामान्य मानव सीरम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और बायोफिल्म को ऑप्सॉनाइज करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
सीरम घोल को एस्पिरेट करें और एचबीएसएस के 150 माइक्रोलीटर के साथ बायोफिल्म को ड्रॉपवाइज धोएं। एचबीएसएस को एस्पिरेट करें, ओप्सोनाइज्ड बायोफिल्म के साथ कुओं को पीछे छोड़ दें। पांच माइक्रोमोलर ल्यूमिनोल की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए एचबीएसएस में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करने के लिए ल्यूमिनोल जोड़ें।
यह समाधान समूह ए और सी के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है। ऑप्सोनाइज्ड बायोफिल्म के साथ कुओं में ल्यूमिनोल के साथ मिश्रित न्यूट्रोफिल जोड़ें। समूह डी के लिए, एचबीएसएस में 50 माइक्रोमोलर ल्यूमिनोल समाधान तैयार करें, बिना किसी न्यूट्रोफिल के एक अलग ट्यूब में, और इसे बायोफिल्म युक्त कुएं में जोड़ें। 350 माइक्रोलीटर न्यूट्रोफिल को ल्यूमिनोल के साथ मिलाया जाता है और मिश्रण में 500 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर पीएमए जोड़ता है।
समूह बी के लिए, इस मिश्रण से न्यूट्रोफिल को बायोफिल्म के बिना कुओं में जोड़ें। यह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। प्लेट को 270 आरसीएफ पर 30 सेकंड के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
सुनिश्चित करें कि प्लेट रीडर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है, ल्यूमिनेसेंस और गतिज तीन मिनट के अंतराल के साथ 60 मिनट के लिए पढ़ा जाता है। 60 मिनट के लिए न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन को मापने के लिए प्लेट को प्लेट रीडर में रखें। माइक्रोस्कोपी इमेजिंग को आसान बनाने के लिए जीएफपी व्यक्त करते हुए यूएसए 300 जैसे एस ऑरियस के फ्लोरोसेंट स्ट्रेन का उपयोग करें।
5% वायुमंडलीय कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर में 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोमोलर बीसीडी के साथ न्यूट्रोफिल को इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि नमूने अंधेरे में इनक्यूबेट किए गए हैं, और प्रकाश जोखिम को सीमित करते हैं। अतिरिक्त बीसीडी को धोने के लिए, सेंट्रीफ्यूज न्यूट्रोफिल को पांच मिनट के लिए 270 आरसीएफ पर रखें, और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
ताजा एचबीएसएस में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें। फिर न्यूट्रोफिल और जीवाणु मृत्यु की निगरानी के लिए चार माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता पर बीसीडी-दाग वाले न्यूट्रोफिल में एथिडियम होमोडिमर -1 जोड़ें। बायोफिल्म को एचबीएसएस के साथ धोएं और माइक्रोस्लाइड्स में उगाए गए एस ऑरियस बायोफिल्म में न्यूट्रोफिल के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।
माइक्रोस्लाइड्स को 30 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में इनक्यूबेट करें। जीवाणु कोशिकाओं की संख्या 18 घंटे के बायोफिल्म प्लेटिंग से प्राप्त सेल गणना पर आधारित होगी। फ्लोरोसेंट रंगों, या प्रोटीन की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अनुरूप फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करके न्यूट्रोफिल बायोफिल्म इंटरैक्शन की छवि।
बैक्टीरियल ग्रोथ मीडिया ने इनक्यूबेशन अवधि के 30 मिनट के बाद न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता को लगभग 60% तक कम कर दिया। स्तनधारी सेल संस्कृति मीडिया, हालांकि, न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है, और एस ऑरियस बायोफिल्म के विकास का भी समर्थन कर सकता है। नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले पीएमए के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल ने आरओएस उत्पादन में वृद्धि दिखाई।
बायोफिल्म की अनुपस्थिति में, पीएमए के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल ने मजबूत आरओएस उत्पादन दिखाया। ऑरियस बायोफिल्म की उपस्थिति में, पीएमए के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल द्वारा समग्र आरओएस उत्पादन में कमी आई, जबकि पीएमए की अनुपस्थिति में, न्यूट्रोफिल पूरी तरह से बायोफिल्म के साथ अपनी बातचीत पर निर्भर थे, जिससे आरओएस उत्पादन कम हो गया। वाइडफील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से पता चला कि कई न्यूट्रोफिल सतह पर स्थानीयकृत थे, जबकि कुछ एस ऑरियस बायोफिल्म के भीतर थे।
न्यूट्रोफिल के साथ बातचीत करने वाली अधिकांश एस ऑरियस कोशिकाएं मृत थीं, जबकि कुछ जीवित / मृत धुंधलापन द्वारा निर्धारित किए गए अनुसार जीवित रहे। एथिडियम होमोडिमर -1-सना हुआ बायोफिल्म ने बायोफिल्म के भीतर मृत एस ऑरियस आबादी का एक अंश प्रकट किया। गैर-पालन न्यूट्रोफिल को हटाने के लिए इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल को धोने के प्रभाव से पता चला कि लगभग 33% मृत न्यूट्रोफिल अभी भी बायोफिल्म से जुड़े थे।
यहां सूचीबद्ध प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूट्रोफिल की अन्य कार्यात्मकताओं, जैसे फागोसाइटोसिस, और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप के गठन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जब न्यूट्रोफिल बायोफिल्म का सामना करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन के अध्ययन का वर्णन करता है। स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म विट्रो में स्थापित किए जाते हैं और परिधीय रक्त-व्युत्पन्न मानव न्यूट्रोफिल के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं। न्यूट्रोफिल से ऑक्सीडेटिव विस्फोट प्रतिक्रिया निर्धारित की जाती है, और बायोफिल्म के भीतर न्यूट्रोफिल स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है।
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