これらのプロトコルは、ヒト好中球が細菌バイオフィルムとどのように相互作用して殺すかを理解するように設計されています。目標は、これをよりよく理解し、アッセイ間の変動を制限し、ドナーからドナーへの変動からヒト好中球に固有の問題があることを理解することです。ここにリストされている技術は、特に緩く付着したバイオフィルムを使用して、ユーザーが最小限の変動で実験を実行できるように最適化されています。
さらに、これらのプロトコルは、バイオフィルムを形成する可能性のある他の微生物の研究にも適合させることができます。まず、トリプシン大豆寒天培地などの栄養豊富な寒天プレート上のストリークプレート技術を使用して、凍結保存されたストックから黄色ブドウ球菌の単離されたコロニーを取得します。96ウェルプレートの個々のウェルを滅菌水で希釈した100マイクロリットルのPLLでコーティングし、室温で30分間インキュベートします。
真空アシスト吸引トラップを使用してPLL溶液を無菌的に吸引します。ウェルを室温で一晩乾燥させます。黄色ブドウ球菌のコロニーに2%グルコースを添加したMEM-αに接種し、摂氏37度で毎分200回転で16〜18時間インキュベートすることにより、一晩培養を準備します。
50マイクロリットルを2%グルコースを添加した5ミリリットルの新鮮なMEM-αに移して、一晩培養液を希釈します。次に、対数中期が達成されるまで、毎分200回転で摂氏37度でインキュベートします。MEM-alpha を使用して、中間対数培養をOD 0.1 に正規化します。
150マイクロリットルの標準化培養液をPLL処理96ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを摂氏37度の加湿チャンバーで18〜20時間インキュベートします。上清を吸引して浮遊細胞を除去する。
残りのバイオマスを150マイクロリットルのHBSSで穏やかに洗浄し、付着していない細胞を取り除きます。少なくとも2回繰り返して、すべての浮遊細胞を取り除きます。洗浄したバイオフィルムにHBSSで希釈した100マイクロリットルの20%正常ヒト血清を滴下し、摂氏37度で30分間インキュベートしてバイオフィルムをオプソニン化します。
血清溶液を吸引し、バイオフィルムを150マイクロリットルのHBSSで滴下して洗浄する。HBSSを吸引し、オプソニン化されたバイオフィルムを含むウェルを残します。HBSSに再懸濁した好中球にルミノールを加えて、最終濃度5マイクロモルのルミノールを作ります。
この溶液は、グループAおよびC.Moreにすぐに使用でき、ルミノールと混合した好中球をオプソニン化されたバイオフィルムを含むウェルに追加します。グループDの場合、好中球を含まない別のチューブにHBSS中の50マイクロモルのルミノール溶液を調製し、バイオフィルムを含むウェルに追加します。ルミノールと混合した350マイクロリットルの好中球を分注し、ミリリットルあたり500ナノグラムの最終濃度でPMAを混合物に加える。
グループBの場合、この混合物からの好中球をバイオフィルムのないウェルに追加します。これはポジティブコントロールとして機能します。プレートを270 RCFで摂氏4度で30秒間遠心分離します。
プレートリーダーが摂氏37度に設定されていることを確認し、発光と運動を3分間隔で60分間読み取ります。プレートをプレートリーダーに入れて、好中球によるROS産生を60分間測定します。顕微鏡イメージングを容易にするために、GFPを発現するUSA300などの黄色ブドウ球菌の蛍光株を使用します。
好中球を100マイクロモルのBCDで、摂氏37度のロッカーで5%大気中の二酸化炭素で30分間インキュベートします。サンプルが暗闇でインキュベートされていることを確認し、光への露出を制限します。余分なBCDを洗浄するには、好中球を270 RCFで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
好中球を新鮮なHBSSに再懸濁します。次に、エチジウムホモ二量体-1をBCD染色好中球に最終濃度4マイクロモルで添加し、好中球と細菌の死を監視します。HBSSでバイオフィルムを洗浄し、マイクロスライドで成長させた黄色ブドウ球バイオフィルムに150マイクロリットルの好中球を追加します。
マイクロスライドを加湿チャンバーで30分間インキュベートします。細菌細胞の数は、18時間のバイオフィルムプレーティングから得られた細胞数に基づく。蛍光色素に対応する蛍光チャネル、またはタンパク質の励起波長と発光波長を使用して、好中球バイオフィルム相互作用を画像化します。
細菌増殖培地は、インキュベーション期間の30分後に好中球の生存率を約60%に最小化しました。しかし、哺乳類細胞培養培地は好中球の生存率に影響を与えず、黄色ブドウ球バイオフィルムの成長をサポートすることもできます。対照として用いたPMAで処理した好中球は、ROS産生の増加を示した。
バイオフィルムが存在しない場合、PMAで処理された好中球は堅牢なROS産生を示した。黄色ブドウ球菌バイオフィルムの存在下では、PMAで処理された好中球による全体的なROS産生は減少したが、PMAの非存在下では、好中球はバイオフィルムとの相互作用のみに依存し、ROS産生をさらに減少させた。広視野蛍光顕微鏡は、多くの好中球が表面に局在し、いくつかは黄色ブドウ球バイオフィルム内にあることを明らかにしました。
好中球と相互作用する黄色ブドウ球菌細胞のほとんどは死んでいましたが、LIVE/DEAD染色によって決定されたように、いくつかは生きたままでした。エチジウムホモ二量体-1染色されたバイオフィルムは、バイオフィルム内の死んだ黄色ブドウ球菌集団の一部を明らかにした。30分間のインキュベーション後にバイオフィルムと好中球を洗浄して非付着好中球を除去する効果は、死んだ好中球の約33%がまだバイオフィルムに付着していることが明らかになりました。
ここにリストされているプロトコルは、食作用や好中球がバイオフィルムに遭遇したときの好中球細胞外トラップの形成など、好中球の他の機能をさらに研究するためにも使用できます。
