이 프로토콜은 인간 호중구가 박테리아 생물막과 상호 작용하고 죽이는 방법을 이해하도록 설계되었습니다. 목표는 이를 더 잘 이해하고 분석에서 분석으로의 변동성을 제한하여 기증자에서 기증자 변이에 인간 호중구에 고유한 문제가 있음을 이해하는 것입니다. 여기에 나열된 기술은 사용자가 특히 느슨하게 부착된 생물막으로 최소한의 변동성으로 실험을 수행할 수 있도록 최적화되었습니다.
또한 이러한 프로토콜은 생물막을 형성 할 수있는 다른 미생물을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다. 트립신 대두 한천과 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트에 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 냉동 보존 된 주식에서 황색 포도상 구균의 분리 된 콜로니를 얻는 것으로 시작하십시오. 96웰 플레이트의 개별 웰을 멸균수에 희석한 100마이크로리터의 PLL로 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 무균적으로 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 말리십시오. 2% 포도당이 보충된 MEM-알파에 S.aureus의 콜로니를 접종하고 섭씨 37도에서 분당 200회전으로 16-18시간 동안 배양하여 야간 배양을 준비합니다.
2 % 포도당이 보충 된 50 밀리리터의 신선한 MEM- 알파에 50 마이크로 리터를 옮겨 밤새 배양 물을 희석하십시오. 그런 다음 중간 로그 위상이 달성 될 때까지 분당 200 회전으로 섭씨 37도에서 배양합니다. MEM-alpha를 사용하여 중간 로그 배양을 OD 0.1로 정규화합니다.
150마이크로리터의 정규화된 배양물을 PLL 처리된 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습 챔버에서 18 내지 20시간 동안 배양한다. 상청액을 흡인하여 플랑크톤 세포를 제거합니다.
150 마이크로 리터의 HBSS로 남아있는 바이오 매스를 부드럽게 씻어 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 모든 플랑크톤 세포를 제거하기 위해 적어도 두 번 반복하십시오. HBSS에 희석 된 20 % 정상 인간 혈청 100 마이크로 리터를 세척 된 생물막에 적가하고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하여 생물막을 옵 소닉합니다.
혈청 용액을 흡인하고 150 마이크로리터의 HBSS로 생물막을 적가한다. HBSS를 흡인하여 옵소닉화된 생물막이 있는 우물을 남깁니다. HBSS에 재현탁된 호중구에 루미놀을 첨가하여 5개의 마이크로몰 루미놀의 최종 농도를 구성합니다.
이 용액은 그룹 A 및 C에 사용할 준비가되어 있으며 루미놀과 혼합 된 호중구를 옵 소니 화 된 생물막이있는 웰에 추가합니다. 그룹 D의 경우, 호중구가없는 별도의 튜브에서 HBSS의 50 마이크로 몰 루미놀 용액을 준비하고 생물막이 들어있는 웰에 첨가하십시오. 루미놀과 혼합 된 호중구 350 마이크로 리터를 분취하고, 혼합물에 밀리리터 당 500 나노 그램의 최종 농도로 PMA를 첨가한다.
그룹 B의 경우,이 혼합물의 호중구를 생물막이없는 우물에 첨가하십시오. 이것은 긍정적 인 대조군으로 작용합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 30초 동안 270RCF로 원심분리합니다.
플레이트 리더가 섭씨 37도로 설정되어 있고 발광 및 키네전이 3분 간격으로 60분 동안 판독되는지 확인합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 60분 동안 호중구에 의한 ROS 생성을 측정합니다. 현미경 이미징을 용이하게 하기 위해 GFP를 발현하는 USA300과 같은 S.aureus의 형광 균주를 사용하십시오.
호중구를 100 마이크로 몰 BCD로 30 % 대기 중 이산화탄소와 함께 섭씨 37 도의 로커에서 5 분 동안 배양합니다. 샘플이 어둠 속에서 배양되었는지 확인하고 빛 노출을 제한하십시오. 과량의 BCD를 세척하기 위해, 호중구를 270 RCF에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인한다.
새로운 HBSS에서 호중구를 다시 중단하십시오. 그런 다음 에티듐 동종이량체-1을 BCD 염색된 호중구에 최종 농도 4개의 마이크로몰로 추가하여 호중구 및 박테리아 사멸을 모니터링합니다. HBSS로 생물막을 씻고 마이크로 슬라이드에서 성장한 S.aureus 생물막에 150 마이크로 리터의 호중구를 첨가하십시오.
마이크로 슬라이드를 가습 챔버에서 30 분 동안 배양합니다. 박테리아 세포의 수는 18시간 생물막 도금으로부터 수득된 세포 수에 기초할 것이다. 형광 염료 또는 단백질의 여기 및 방출 파장에 해당하는 형광 채널을 사용하여 호중구 생물막 상호 작용을 이미지화합니다.
박테리아 성장 배지는 잠복기 30분 후 호중구의 생존율을 약 60%로 최소화했습니다. 그러나 포유류 세포 배양 배지는 호중구의 생존력에 영향을 미치지 않았으며 S.aureus 생물막의 성장을 지원할 수도 있습니다. 대조군으로 사용된 PMA로 처리된 호중구는 증가된 ROS 생산을 보였다.
생물막이없는 경우, PMA로 처리 된 호중구는 강력한 ROS 생산을 보였다. S.aureus 생물막이 있는 경우 PMA로 처리된 호중구에 의한 전체 ROS 생성이 감소한 반면, PMA가 없는 경우 호중구는 생물막과의 상호 작용에만 의존하여 ROS 생성을 더욱 감소시켰습니다. 광시야 형광 현미경 검사 결과 많은 호중구가 표면에 국한된 반면 일부는 S.aureus 생물막 내에 있음이 밝혀졌습니다.
호중구와 상호 작용하는 대부분의 S.aureus 세포는 죽었고, 일부는 LIVE / DEAD 염색에 의해 결정된대로 살아 남았습니다. 에티듐 호모다이머-1-염색된 생물막은 생물막 내에서 죽은 S.aureus 개체군의 일부를 드러냈습니다. 배양 30분 후 생물막과 호중구를 세척하여 부착되지 않은 호중구를 제거한 효과는 죽은 호중구의 약 33%가 여전히 생물막에 부착되어 있는 것으로 나타났습니다.
여기에 나열된 프로토콜은 또한 식균 작용 및 호중구가 생물막을 만날 때 호중구 세포 외 트랩 형성과 같은 호중구의 다른 기능을 추가로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
