Dessa protokoll är utformade för att förstå hur mänskliga neutrofiler interagerar med och dödar bakteriella biofilmer. Målet är att bättre förstå detta och att begränsa variationen från analys till analys och förstå att det finns inneboende problem med mänskliga neutrofiler från givare till givarvariation. Teknikerna som listas här har optimerats för att tillåta användarna att utföra experiment med minimal variabilitet, särskilt med löst fästa biofilmer.
Dessutom kan dessa protokoll också anpassas för att studera andra mikrober som kan bilda biofilmer. Börja med att erhålla isolerade kolonier av Staphylococcus aureus från ett kryokonserverat lager med hjälp av en strimplatteteknik på en näringsrik agarplatta, såsom tryptisk sojaagar. Täck enskilda brunnar i en 96-brunnsplatta med 100 mikroliter PLL utspädd i sterilt vatten och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
Aspirera PLL-lösningen aseptiskt med hjälp av en vakuumassisterad aspirationsfälla. Låt brunnarna torka över natten vid rumstemperatur. Förbered en nattkultur genom att ympa en koloni av S.aureus i MEM-alfa kompletterad med 2% glukos och inkuberas vid 37 grader Celsius i 16 till 18 timmar vid 200 rotationer per minut.
Späd över natten kultur genom att överföra 50 mikroliter till fem milliliter färsk MEM-alfa kompletterad med 2% glukos. Inkubera sedan den vid 37 grader Celsius vid 200 rotationer per minut tills mitten av logaritmisk fas uppnås. Använd MEM-alfa för att normalisera mitten av logaritmisk kultur till en OD på 0,1.
Överför 150 mikroliter normaliserad kultur till varje brunn i den PLL-behandlade 96-brunnsplattan. Inkubera plattan i en fuktad kammare vid 37 grader Celsius i 18 till 20 timmar. Aspirera supernatanten för att ta bort planktoncellerna.
Tvätta försiktigt den återstående biomassan med 150 mikroliter HBSS för att ta bort de obundna cellerna. Upprepa minst två gånger för att ta bort alla planktoniska celler. Tillsätt 100 mikroliter 20% normalt humant serum utspätt i HBSS droppvis till den tvättade biofilmen och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 minuter för att opsonisera biofilmen.
Aspirera serumlösningen och tvätta biofilmerna droppvis med 150 mikroliter HBSS. Aspirera HBSS och lämna efter sig brunnar med opsoniserade biofilmer. Tillsätt luminol till neutrofilerna som återsuspenderas i HBSS för att bilda en slutlig koncentration av fem mikromolära luminol.
Denna lösning är klar att användas för grupperna A och C.Lägg till neutrofiler blandade med luminol till brunnarna med opsoniserade biofilmer. För grupp D, bered 50 mikromolär luminollösning i HBSS i ett separat rör utan neutrofiler och tillsätt den till brunnen innehållande biofilmen. Alikvotera 350 mikroliter neutrofiler blandade med luminol och tillsätt PMA i en slutlig koncentration av 500 nanogram per milliliter till blandningen.
För grupp B, tillsätt neutrofilerna från denna blandning i brunnar utan biofilm. Detta fungerar som en positiv kontroll. Centrifugera plattan vid 270 RCF i 30 sekunder vid fyra grader Celsius.
Se till att plattläsaren är inställd på 37 grader Celsius, luminescens- och kinetisk läsning i 60 minuter med tre minuters intervall. Placera plattan i plattläsaren för att mäta ROS-produktion med neutrofiler i 60 minuter. Använd en fluorescerande stam av S.aureus, såsom USA300, som uttrycker GFP för att underlätta mikroskopiavbildning.
Inkubera neutrofiler med 100 mikromolar BCD i 30 minuter i en vippa vid 37 grader Celsius med 5% atmosfärisk koldioxid. Se till att proverna inkuberas i mörkret och begränsa ljusexponeringen. För att tvätta överskott av BCD, centrifugera neutrofiler vid 270 RCF i fem minuter och aspirera supernatanten.
Återupphäng neutrofilerna i färsk HBSS. Tillsätt sedan etidiumhomodimer-1 till de BCD-färgade neutrofilerna i en slutlig koncentration av fyra mikromolar för att övervaka neutrofil och bakteriedöd. Tvätta biofilmen med HBSS och tillsätt 150 mikroliter neutrofiler till S.aureus-biofilmen som har odlats i mikroslider.
Inkubera mikrobilderna i en fuktad kammare i 30 minuter. Antalet bakterieceller kommer att baseras på cellantalet erhållet från 18-timmars biofilmplätering. Avbilda den neutrofila biofilminteraktionen med hjälp av fluorescerande kanaler som motsvarar fluorescerande färgämnen, eller proteiners excitations- och emissionsvåglängder.
Bakteriella tillväxtmedier minimerade neutrofilernas livskraft till cirka 60% efter 30 minuters inkubationsperiod. Däggdjurscellodlingsmedier påverkade emellertid inte neutrofilernas livskraft och kan också stödja tillväxten av S.aureus-biofilmer. Neutrofiler behandlade med PMA som användes som kontroll visade en ökad ROS-produktion.
I avsaknad av biofilmer visade neutrofiler behandlade med PMA robust ROS-produktion. I närvaro av S.aureus-biofilm minskade den totala ROS-produktionen av neutrofiler behandlade med PMA, medan neutrofiler i frånvaro av PMA enbart förlitade sig på deras interaktion med biofilmen, vilket ytterligare minskade ROS-produktionen. Widefield fluorescerande mikroskopi avslöjade att många neutrofiler var lokaliserade till ytan medan några var inom S.aureus biofilmer.
De flesta av S.aureus-cellerna som interagerade med neutrofiler var döda, medan några förblev vid liv enligt LIVE / DEAD-färgning. Ethidium homodimer-1-färgade biofilmer avslöjade en bråkdel av den döda S.aureus-befolkningen inom biofilmen. Effekten av att tvätta biofilmen och neutrofilerna efter 30 minuters inkubation för att avlägsna icke-vidhäftade neutrofiler avslöjade att cirka 33% av döda neutrofiler fortfarande var fästa vid biofilmen.
Protokollen som listas här kan också användas för att ytterligare studera andra funktioner hos neutrofiler, såsom fagocytos och bildning av neutrofila extracellulära fällor när neutrofiler stöter på biofilmer.