Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Forfatterne er julie Merkle taknemmelige for hendes nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH-bevilling R15GM137236 til O.D. De konfokale og superopløsningsbilleder blev erhvervet ved hjælp af en Zeiss LSM 900 med Airyscan 2, købt med NSF MR-tilskud 2018748.

1. Flyv forberedelse til æggestokkens dissektioner
<ol><li>Sæt 10-15 Drosophila melanogaster hunfluer (1-2 dage gamle) af den ønskede genotype i et smalt hætteglas indeholdende ~ 8 ml Drosophila fluesmedium drysset med en lille mængde granuleret bagergær 2-3 dage før dissektion ved 25 ° C. Tilføjelse af et par hanner til hætteglasset kan øge ægkammerets udbytte. Sørg dog for, at det samlede antal fluer ikke overstiger 20, da dette kan påvirke æggestokkenes udvikling ne...

BM er kritisk for embryonal og organmorfogenese og voksne fysiologiske funktioner. Desuden fungerer BM som en signalplatform til etablering og vedligeholdelse af epitelpolaritet og giver væv støtte2. Alligevel er de mekanismer, der regulerer den korrekte placering af BM-proteiner, dårligt forstået. En bedre forståelse af de biologiske veje dedikeret til intracellulær handel og polariseret sekretion af BM-proteiner kræver en omhyggelig analyse af komponenterne i disse veje og deres roller i ...

Kældermembranen (BM) er et tyndt ark af lagdelt celleadhærent ekstracellulær matrix (ECM), der er kritisk for epitelstruktur og morfogenese1. Det består af ~ 50 proteiner og findes allestedsnærværende underliggende epitel- og endotelcellerne og indhyller skelet-, glatte- og hjertemuskelceller og adipocytter 1,2,3. De tre hovedkomponenter i BM på den basale side af epitelcellerne er kollagen IV, perlecan og lamininer. BM ligger til grund for epitelcellerne og er ansvarlig for mange funktioner, herunder vævsseparation og barriere, vækst og støtte og cellepolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dens rolle som signalplatform regulerer morfologien og differentieringen af epitelceller og væv under udvikling 3,13,14. Desuden er misregulering af BM og / eller et brud på dets integritet de primære årsager til mange patologiske tilstande, herunder tumormetastase 2,15,16. På trods af de væsentlige funktioner, der udføres af BM under vævs- og organmorfogenese, er komponenterne i den biologiske vej (er) dedikeret til polariseret intracellulær handel og sekretion af BM-proteiner vagt kendt.
For at studere den intracellulære handel med BM-holdige vesikler og udskillelsen af BM-proteiner af epitelceller er follikulært epitel (FE) i Drosophila-æggestokken et kraftfuldt modelsystem (figur 1). En Drosophila æggestok består af 16-20 lange, rørlignende strukturer, kaldet ovarioler (figur 1A,B)17,18,19. Hver ovariole kan betragtes som et æg samlebånd, med alder progression af ægkamre (som hver giver anledning til et æg), der begynder i den forreste ende og bevæger sig bagud, indtil det modne æg går ud gennem ovidukten. Hvert ægkammer er indkapslet af FE, et monolag af somatiske follikelceller (FC'er), der omgiver de centrale kimlinjeceller (GC'er). FE er stærkt polariseret med en tydelig apikal-basal polaritet, hvor det apikale domæne vender mod kimlinjen, og BM-proteinerne udskilles basalt 18,19. FCs udskiller aktivt alle de vigtigste komponenter i BM, herunder Collagen IV, Perlecan og Laminins20,21. I epitelceller såsom FC'er produceres BM-komponenterne og kræver en specialiseret polariseret sekretionsvej til deres aflejring ekstracellulært. For eksempel i tilfælde af den mest rigelige komponent i BM, Collagen IV (Coll IV), er detaljerne omkring dens polariserede intracellulære handel og sekretion vage på trods af at dens produktion og aflejring er fokus for mange undersøgelser. Coll IV oversættes i det endoplasmatiske retikulum (ER), hvilket også er hvor hver fibril - sammensat af tre polypeptider (to α1-kæder og en α2-kæde) - samles i en tredobbelt helix22. Korrekt Coll IV-foldning og funktion kræver ER-chaperoner og enzymer, herunder lysyl- og prolylhydroxylaser såsom Plod og PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Disse posttranslationelle enzymer regulerer ER-sorteringen af Coll IV, da tabet af hver forårsager, at Coll IV bliver fanget i basal ER 20,23,24,25,26. Derefter forlader nyligt syntetiseret Coll IV ER for Golgi i COPII-belagte vesikler. Lastreceptoren Tango1 hjælper med at pakke kollagener i betydelige Golgi-bundne vesikler, der kan rumme store multimere proteiner20,27. Når Coll IV er pakket i intracellulære eksocytiske vesikler, udskilles det specifikt basalt fra epitelceller. For at lede BM-aflejring til basalsiden kræver epitelceller et andet sæt faktorer, der specifikt er dedikeret til polariseret BM-sekretion. Ved hjælp af FE af Drosophila æggestokken er nogle få komponenter i denne nye cellulære proces blevet karakteriseret, herunder nukleotidudvekslingsfaktorerne (GEFs) Crag og Stratum, GTPaserne Rab8 og Rab10 samt niveauerne af phosphoinositide PI (4,5) P2 og Kinesin 1 og 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Disse komponenter er afgørende for at sikre den polariserede fordeling af BM-proteiner.
For at overvåge den intracellulære lokalisering af BM-proteiner i FE kan endogent mærkede kældermembranproteiner (proteinfælder), såsom Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) og Perlecan-GFP (Pcan-GFP) anvendes32,33. Disse proteinfældelinjer har vist sig nøjagtigt at afspejle den endogene fordeling af BM-proteiner og muliggøre mere følsom påvisning af vesikulær handel28,30. Komponenterne involveret i den polariserede aflejring af BM i FE blev først karakteriseret ved hjælp af proteinfældelinjer til Vkg-GFP og Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfælder kan bruges i forskellige genetiske baggrunde, herunder mutanter og Gal4 linjer34. Desuden kan proteinfælder anvendes i kombination med fluorescerende farvestoffer og/eller fluorescensimmunopstaining, hvilket muliggør præcis karakterisering af lokaliseringen af BM-proteiner, når man sammenligner vildtype og mutantbetingelser35.
For nøjagtigt og effektivt at vurdere distributionen og lokaliseringen af BM-proteinholdige vesikler udgør konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) og billeddannelsesteknikker med superopløsning en betydelig fordel for andre billeddannelsesmetoder. Disse tilgange kobler billedbehandling i høj opløsning med relativ brugervenlighed. CLSM er en mikroskopiteknik, der giver mulighed for en forbedret optisk opløsning ved at scanne prøven med en laser på en rasterscannings måde ved hjælp af galvanometre. Pinhole blænden er en kernekomponent i et konfokalt mikroskop. Ved at blokere de ude af fokussignaler, der kommer ovenfra eller under brændplanet, resulterer pinhole-blænden i en meget overlegen opløsning i z-aksen36. Dette gør det også muligt at opnå en række billeder i z-planet, kaldet en z-stak, svarende til en række optiske sektioner. z-stacks skaber efterfølgende et 3D-billede af prøven via 3D-rekonstruktion ved hjælp af billedbehandlingssoftware. Konventionelle epifluorescensmikroskoper (widefield), i modsætning til konfokale mikroskoper, tillader lys uden for fokus at bidrage til billedkvalitet, faldende billedopløsning og kontrast36,37. Dette gør epifluorescensmikroskopi til en mindre attraktiv kandidat, når man studerer proteinlokalisering eller kolonisering.
Selvom CLSM er en passende tilgang til forskellige applikationer, herunder billeddannelse og karakterisering af den intracellulære handel med BM-proteiner, udgør det stadig et problem, når der afbildes prøver under Abbes diffraktionsgrænse for lys (200-250 nm). Ved billeddannelse af sådanne prøver kan konfokal mikroskopi, især ved brug af et oliemål, resultere i høj opløsning. Superopløsningsteknikker overstiger imidlertid grænsen for konfokal mikroskopi. Der er forskellige tilgange til at opnå superopløsningsmikroskopi, hver med specifikke opløsningsgrænser, og hver passende til forskellige analyser. Disse tilgange omfatter fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi (STED), struktureret belysningsmikroskopi (SIM) og Airyscan (superopløsning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Selvom Airyscan har en grovere opløsning end PALM/STORM, STED og SIM, kan den stadig opnå en opløsning på op til ~120 nm (ca. det dobbelte af CLSM's opløsning). Desuden har denne superopløsningsmikroskopimetode vist sig at have en fordel i forhold til SIM og andre superopløsningsteknikker ved billeddannelse af tykke prøver og prøver med et lavt signal/støj-forhold 47,48.
Airyscan er en relativt ny superopløsning konfokal mikroskopiteknologi46. I modsætning til traditionelle CLSM'er, der bruger pinhole- og enkeltpunktsdetektorer til at afvise lys, der er ude af fokus, bruger denne superopløsningsmetode en 32-kanals galliumarsenidphosphid (GaAsP) fotomultiplierrørområdedetektor, der samler alt lyset ved hver scanningsposition45. Hver af de 32 detektorer fungerer som et lille pinhole, hvilket reducerer pinhole-størrelsen fra den traditionelle 1.0 Airy Unit (A.U.) til en forbedret 0.2 A.U., hvilket muliggør en endnu højere opløsning og signal-støj-forhold, samtidig med at effektiviteten af en 1.25 A.U. diameter45 opretholdes. Desuden resulterer den lineære dekonvolution, der anvendes af Airyscan, i op til en 2x stigning i opløsning45. Under hensyntagen til dette er CLSM, og specifikt superopløsningsmikroskopi, velegnet til at studere BM-proteiner og proteiner, der regulerer den basale aflejring af BM-proteiner, da de kan producere billeder i meget høj opløsning til lokaliserings- og koloniseringsundersøgelser og derved give ny indsigt i de rumlige, tidsmæssige og molekylære begivenheder, der styrer disse processer.
En alternativ tilgang til konfokal mikroskopi, der kan bruges til at udføre lokaliseringseksperimenter, er billeddekonvolution. Da widefield-mikroskopi gør det muligt for lys, der ikke er i fokus, at nå detektorerne, kan matematiske og beregningsmæssige dekonvolutionsalgoritmer anvendes til at fjerne eller omfordele lys uden for fokus fra billeder opnået ved widefield-mikroskopi og derved forbedre billedets opløsning og kontrast49. Dekonvolutionsalgoritmer kan også anvendes på konfokale billeder for yderligere at øge opløsning og kontrast, hvilket producerer endelige billeder, der næsten kan sammenlignes med superopløsningsmikroskopi50. Airyscan gør brug af Weiner filterbaseret dekonvolution sammen med Sheppards pixelomplacering, hvilket resulterer i en stærkt forbedret rumlig opløsning og signal-støj-forhold. Sammenlignet med konfokal mikroskopi observeres en stigning på 2x i opløsning i alle tre rumlige dimensioner (120 nm i x og y og 350 nm i z) ved anvendelse af denne superopløsningsmikroskopiteknik45,51.
Dette manuskript giver detaljerede og optimerede protokoller til at plette, erhverve og visualisere den intracellulære handel og aflejring af BM-proteiner ved hjælp af FE af Drosophila-æggestokken som et modelsystem kombineret med konfokal og superopløsningsmikroskopi. Drosophila-linjer , der udtrykker endogent mærkede kældermembranproteiner, fx Vkg-GFP og Pcan-GFP, er effektive og nøjagtige værktøjer til at visualisere BM-proteinhandel og sekretion. Derudover kan de let bruges i forskellige genetiske baggrunde, herunder mutant og Gal4 / UAS linjer34. Selvom endogent mærkede kældermembranproteiner anbefales, er brugen af antistoffer mod specifikke BM-proteiner også kompatibel med de beskrevne protokoller. Disse protokoller er især nyttige for forskere, der er interesserede i at studere intracellulær handel og udskillelsen af BM-proteiner i intakt epitelvæv ved hjælp af konfokal og superopløsningsbilleddannelse. Desuden gør evnen til at kombinere epitelvævsanalyse med de ekspansive værktøjer i Drosophila genetik denne tilgang særlig kraftfuld. Endelig kunne disse protokoller let tilpasses til at studere vesikulær handel og sortering af andre proteiner af interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

Kældermembranen (BM) - et specialiseret ark ekstracellulær matrix til stede på den basale side af epitelceller - er afgørende for etablering og vedligeholdelse af epitelvævsmorfologi og organmorfogenese. Desuden er BM afgørende for vævsmodellering, der fungerer som en signalplatform og giver eksterne kræfter til at forme væv og organer. På trods af de mange vigtige roller, som BM spiller under normal udvikling og patologiske tilstande, er de biologiske veje, der styrer den intracellulære handel med BM-holdige vesikler, og hvordan basal sekretion fører til polariseret aflejring af BM-proteiner, dårligt forstået. Drosophila-æggestokkens follikulære epitel er et fremragende modelsystem til at studere den basale aflejring af BM-membranproteiner, da det producerer og udskiller alle hovedkomponenter i BM. Konfokal og superopløsningsbilleddannelse kombineret med billedbehandling i faste væv muliggør identifikation og karakterisering af cellulære faktorer, der specifikt er involveret i intracellulær handel og aflejring af BM-proteiner. Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol til farvning og billeddannelse af BM-holdige vesikler og deponeret BM ved hjælp af endogent mærkede proteiner i follikulært epitel i Drosophila-æggestokken . Denne protokol kan anvendes til at løse både kvalitative og kvantitative spørgsmål, og den blev udviklet til at imødekomme screening med høj kapacitet, hvilket muliggør hurtig og effektiv identifikation af faktorer involveret i polariseret intracellulær handel og udskillelse af vesikler under epitelvævsudvikling.

De metoder, der er beskrevet heri, kan bruges til effektivt og præcist at afbilde og karakterisere den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner i polariserede epitelceller, såsom FE i Drosophila-æggestokken . Dernæst giver vi forventede resultater opnået ved hjælp af de beskrevne metoder samt nyttige råd og potentielle faldgruber. For at gøre dette anvendes Vkg-GFP, en endogent mærket Vkg (Drosophila Col IV). Imidlertid kan de samme resultater opnås med andre endogent mærkede BM-pr...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Kældermembranen er afgørende for vævs- og organmorfogenese under udvikling. For bedre at forstå de mekanismer, der fører til korrekt placering af denne struktur, beskriver den præsenterede protokol metoder til at visualisere og karakterisere intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner i epitelceller ved hjælp af konfokal og superopløsningsmikroskopi.

Konfokal og superopløsningsbilleddannelse af polariseret intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner under Drosophila oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Denne protokol tillader karakterisering af intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner ved hjælp af Drosophila-arrayet som et modelsystem. Den største fordel ved vores teknik er, at den tillader billeddannelse i høj opløsning af intracellulær handel med kældermembranproteiner ved hjælp af endogent mærkede proteiner og Airyscan superopløsningsmikroskopi. Selvom denne protokol er udviklet til at afbilde den intracellulære handel med kældermembranproteiner, kan den udvides til at studere handel med andre proteiner af interesse og andre biologiske systemer, herunder cellekultur og organoider.Til at begynde med, efter dissekering af Drosophila æggestokke i PBS under et dissekeringsomfang, tilsættes en milliliter fikseringsopløsning og fastgør æggestokkene på en nutating platform i 15 minutter. Fjern fikseringsopløsningen, og udfør to hurtige vaske, hver med en milliliter PBST. Ved forsigtigt at invertere mikrocentrifugerørene fem til seks gange, udfør derefter fire lange vaske på 10 minutter hver med en milliliter PBST på en nutating platform vippe.Efter udførelse af fiksering og vask skal du fjerne PBST, derefter tilsætte en milliliter blokeringsopløsning og blokere æggestokkene på en nutating platform vippe i mindst en time. Derefter fjernes blokeringsopløsningen og tilsættes 300 mikroliter primær antistofopløsning, indeholdende primære antistoffer fortyndet i deres passende koncentrationer i blokerende opløsning. Inkuber natten over på en nutating platform rocker ved 4 grader Celsius.Efter fjernelse af den primære antistofopløsning udføres to hurtige vaske og fire lange vaske, som tidligere demonstreret, fjern derefter PBST og tilsæt 500 mikroliter sekundær antistofopløsning indeholdende fluorescerende sekundære antistoffer, der detekterer de primære antistoffer, der anvendes. Inkuber æggestokkene i den sekundære antistofopløsning på en nutating platform vippe i to timer ved stuetemperatur, og udfør derefter to hurtige vaske og fire lange vaske i PBST som tidligere demonstreret på en nutating platform vippe. Efter den sidste vask skal du bruge en P-1000 pipette til forsigtigt at pipettere æggestokkene op og ned i røret for at adskille ægkamrene.Lad ægkamrene synke til bunden ved at holde røret i opretstående stilling i fem til 10 minutter. Fjern derefter PBST ved hjælp af en Pasteur-pipette, der efterlader ca. 50 mikroliter. Fjern derefter så meget af den resterende PBST som muligt ved hjælp af en P-200 pipette og tilsæt to dråber monteringsmedium, nok til at sprede jævnt på en dækslip.For at muliggøre let overførsel af det viskøse monteringsmedium til diaset fra mikrocentrifugerøret skal du afskære enden af en P-200 pipettespids. Derefter overføres langsomt alle ægkamrene i monteringsmediet til glasglasset, hvilket sikrer, at der ikke dannes bobler. Under et dissekeringsmikroskop spredes forsigtigt monteringsmediet og adskilles ægkamre ved hjælp af en ny P-200 pipettespids eller tang for at dække et område, der er omtrent på størrelse med en dækslip.Brug pincet til forsigtigt at placere dækslippen på ægkamrene i en vinkel for at undgå bobler og opbevar diaset ved stuetemperatur på en plan overflade i mørke i to dage for at polymerisere. Når monteringsmediet er hærdet, kan diaset opbevares ved 4 grader Celsius i mørke i et par uger til billeddannelse. For at visualisere den intracellulære lokalisering af kældermembranproteiner skal du indstille målet til 63x og forsigtigt placere en dråbe nedsænkningsolie på linsen og derefter placere diaset på målet med dækslippet vendt mod målet for at lokalisere prøven.Find det område af interesse ved hjælp af okularet i det epifluorescerende mikroskop, og vælg derefter en konfiguration med passende indstillinger for fluorophorerne til billede som beskrevet i manuskriptet. Når konfigurationen er indstillet, skal du afbilde eksemplet ved at vælge Live under Anskaffelsestilstand og justere zoomen mellem 2 og 4x for at optimere scanningsområdet for prøven. For hver enkelt kanal skal du vælge et spor under Kanal og klikke på Live.Juster masterforstærkningen og lasereffekten, mens du bruger rækkeviddeindikatorværktøjet, og følg alle retningslinjerne for at undgå mættede pixels som beskrevet i manuskriptet, mens du gentager det samme for hver kanal. I vinduet Acquisition Mode under Billedstørrelse skal du klikke på SR for at maksimere detektorens muligheder og justere rammestørrelsen automatisk. Hold gennemsnittet til Ingen i Airyscan-tilstand, da det normalt ikke er nødvendigt og vil reducere scanningstiden.I nogle tilfælde kan et gennemsnit på 2x dog forbedre signal/støj-forholdet og derefter klikke på Snap for at få et billede. For at erhverve en Z-stak skal du klikke på Z-Stack afkrydsningsfeltet under fanen Erhvervelse. Vælg derefter den ønskede kanal for at observere prøven.For eksempel DAPI-kanalen og klik på Live for at starte en live scanning, og indstil derefter et interval for Z-stakken ved hjælp af finjusteringsknappen på mikroskopet. Indstil derefter slutpunkterne for Z-stakken ved at klikke på Indstil først og Indstil sidst. For optimal 3D-rekonstruktion skal du indstille intervallet for Z-stakken lavere end 0,5 mikrometer for at tildele trinstørrelsen og klikke på Start eksperiment for at starte Z-stack-erhvervelsen.Når billederne eller Z-stakken er hentet, skal du klikke på Behandling, derefter Metode mulighed og vælg Airyscan Processing. Udfør Automatisk filtrering for at starte, og udfør om nødvendigt yderligere manuel behandling ved at ændre superopløsningsværdien for at opnå de bedste resultater for prøven. Når den optimale SR-værdi er bestemt, skal du klikke på Anvend for at generere et behandlet billede.I tilfælde af Z-stack-billeder skal du behandle enten som en Z-slice eller som hele Z-stakken ved at klikke på boksen 3D-behandling. For at visualisere proteinhandel med 3D efter erhvervelsen af en Z-stak skal du generere et 3D-billede ved at klikke på 3D-ikonet i eksempelvinduet, der vises i displaykontrolafsnittet i Airyscan-behandlet billede. Fra de forskellige 3D-visningsindstillinger skal du bruge Surface eller Mixed views, når du får vist strukturen af vesikler.For billede af højeste kvalitet skal du vælge indstillingen Præcis, da indstillingen Hurtigste vil være mindre nøjagtig og føre til dårlig 3D-gengivelse. Når billedet er genereret, skal du manipulere 3D-billedet ved at zoome og rotere for at fokusere på et foretrukket sted. Når visningen er opnået, skal du under fanen 3D vælge Vist opløsning og derefter klikke på Opret billede, som opretter et øjebliksbillede af billedet i samme retning som det blev set og kan gemmes og eksporteres i forskellige filformater.Konfokal mikroskopi kan bruges til at visualisere den intracellulære lokalisering og aflejring af kældermembranproteiner såsom Viking-GFP, når anskaffelsesparametrene er optimeret. Når indsamling og billedbehandling udføres korrekt, øger mikroskopi med superopløsning billedopløsning sammenlignet med konfokal mikroskopi. Som illustreret af de bedre definerede billeder i den intracellulære handel med kældermembranproteiner, såsom Viking.Ortogonal projektion muliggør visualisering af den samlede fordeling af vesikler og rum indeholdende kældermembranproteiner i et enkelt billede ved hjælp af konfokal eller superopløsningsbilleddannelse. En 3D-rekonstruktion ved at samle en stak optiske Z-sektioner taget ved konfokal eller superopløsningsbilleddannelse blev anvendt til at vurdere lokalisering og distribution af intracellulære kældermembranproteiner. Superopløsningsbilleddannelse kan bruges til at bestemme den præcise lokalisering af kældermembranproteiner under mutante forhold.For eksempel akkumuleres kældermembranproteiner i Crag knockdown-epitelceller både apikalt og basalt, hvilket indikerer, at det styrer den polariserede udskillelse af kældermembranproteiner. Konfokal og superopløsningsmikroskopi kan også anvendes i co-lokaliseringseksperimenter. For eksempel viser denne figur den delvise co-lokalisering af Viking-GFP og en Golgi-markør, GM-130, hvilket bekræfter, at Viking sorteres til Golgi før sekret.For effektivt at afbilde handelen med kældermembranproteiner ved hjælp af superopløsningsmikroskopi anbefaler vi at omhyggeligt montere æggestokkene og være særlig opmærksom, når du indstiller erhvervelses- og konvolutionsparametrene. Denne protokol er optimeret til at visualisere den intracellulære handel og udskillelse af kældermembranproteiner. Det kan dog let ændres for effektivt at afbilde handelen med andre proteiner af interesse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Konfokal Imaging af Udvikling Arabidopsis Blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som en Model for intracellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese i en enkelt celle: mærkning af normal god landbrugspraksis-fusioner, RNAi interaktion skærm og billedbehandling

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Analyse af epididymis proteinsyntese og sekretion

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Billeddannelse og analyse af vævsorientering og vækstdynamik i udvikling af Drosophila Epithelia under pupalfaser

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualisering af cytoskeletafhængig handel med lipidholdige organeller i drosophilaembryoner

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Brug af ekspansionsmikroskopi til fysisk at forstørre helmonterede Drosophila-embryoner til billeddannelse i superopløsning

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...