Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Les auteurs sont reconnaissants à Julie Merkle pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la subvention R15GM137236 des NIH à O.D. Les images confocales et super-résolution ont été acquises à l’aide d’un Zeiss LSM 900 avec Airyscan 2, acheté avec la subvention NSF IRM 2018748.

1. Préparation des mouches pour les dissections ovariennes
<ol><li>Mettez 10-15 mouches femelles Drosophila melanogaster (âgées de 1 à 2 jours) du génotype souhaité dans un flacon étroit contenant environ 8 mL de milieu de mouche drosophila saupoudré d’une petite quantité de levure de boulanger granulée 2-3 jours avant la dissection à 25 ° C. L’ajout de quelques mâles au flacon peut augmenter le rendement de la chambre à œufs. Cependant, assurez-vous que le nombre ...

Le BM est essentiel pour la morphogenèse embryonnaire et organique, et les fonctions physiologiques adultes. De plus, le BM agit comme une plate-forme de signalisation pour l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale et fournit aux tissus un support2. Pourtant, les mécanismes qui régulent le bon placement des protéines BM sont mal compris. Une meilleure compréhension des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire et à la sécrétion polarisée des protéines BM...

La membrane basale (BM) est une fine feuille de matrice extracellulaire adhérente aux cellules (ECM) en couches essentielle à la structure épithéliale et à la morphogenèse1. Il comprend environ 50 protéines et se trouve partout sous-jacent aux cellules épithéliales et endothéliales, ainsi qu’aux cellules squelettiques, lisses et cardiaques et aux adipocytes 1,2,3. Les trois principaux composants du BM du côté basal des cellules épithéliales sont le collagène IV, le perlécan et les laminines. Le BM sous-tend les cellules épithéliales et est responsable de nombreuses fonctions, y compris la séparation et la barrière tissulaires, la croissance et le soutien, et la polarisation cellulaire 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Son rôle en tant que plate-forme de signalisation régule la morphologie et la différenciation des cellules et tissus épithéliaux au cours du développement 3,13,14. De plus, la mauvaise régulation du BM et/ou une atteinte à son intégrité sont les principales causes de nombreuses affections pathologiques, notamment les métastases tumorales 2,15,16. Malgré les fonctions essentielles exercées par le BM lors de la morphogenèse des tissus et des organes, les composants de la ou des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire polarisé et à la sécrétion de protéines BM sont vaguement connus.
Pour étudier le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la sécrétion de protéines BM par les cellules épithéliales, l’épithélium folliculaire (FE) de l’ovaire de la drosophile est un puissant système modèle (Figure 1). Un ovaire de drosophile comprend 16 à 20 longues structures tubulaires, appelées ovarioles (Figure 1A,B)17,18,19. Chaque ovariole peut être considérée comme une chaîne d’assemblage d’œufs, avec la progression de l’âge des chambres d’œufs (qui donnent chacune naissance à un œuf) qui commence à l’extrémité antérieure et se déplace postérieurement, jusqu’à ce que l’œuf mature sorte par l’oviducte. Chaque chambre à œufs est encapsulée par le FE, une monocouche de cellules folliculaires somatiques (FC), qui entoure les cellules germinales centrales (GC). Le FE est fortement polarisé avec une polarité apicale-basale distincte où le domaine apical fait face à la lignée germinale, et les protéines BM sont sécrétées à la base18,19. Les FC sécrètent activement tous les principaux composants du BM, y compris le collagène IV, le perlécan et les laminines20,21. Dans les cellules épithéliales telles que les FC, les composants BM sont produits et nécessitent une voie de sécrétion polarisée spécialisée pour leur dépôt extracellulaire. Par exemple, dans le cas du composant le plus abondant du BM, le collagène IV (Coll IV), les détails entourant son trafic intracellulaire polarisé et sa sécrétion sont vagues bien que sa production et son dépôt fassent l’objet de nombreuses études. Coll IV est traduit dans le réticulum endoplasmique (RE), où chaque fibrille - composée de trois polypeptides (deux chaînes α1 et une chaîne α2) - est assemblée en une triple hélice22. Le repliement et le fonctionnement appropriés de Coll IV nécessitent des chaperons et des enzymes ER, y compris des lysyl et des prolyl-hydroxylases telles que Plod et PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Ces enzymes post-traductionnelles régulent le tri ER de Coll IV, car la perte de chacune provoque le piégeage de Coll IV dans l’ER basal 20,23,24,25,26. Ensuite, coll IV nouvellement synthétisé sort de l’urgence pour le Golgi dans des vésicules enrobées de COPII. Le récepteur de cargaison Tango1 aide à emballer les collagènes dans d’importantes vésicules liées à Golgi qui peuvent accueillirde grandes protéines multimériques 20,27. Une fois que Coll IV est emballé dans des vésicules exocytaires intracellulaires, il est spécifiquement sécrété par voie basale à partir de cellules épithéliales. Pour diriger le dépôt de BM vers le côté basal, les cellules épithéliales ont besoin d’un autre ensemble de facteurs spécifiquement dédiés à la sécrétion de BM polarisée. En utilisant l’EF de l’ovaire de la drosophile, quelques composants de ce nouveau processus cellulaire ont été caractérisés, y compris les facteurs d’échange de nucléotides (GEF) Crag et Stratum, les GTPases Rab8 et Rab10, ainsi que les niveaux de phosphoinositide PI(4,5)P2 et de protéines motrices Kinesin 1 et 3 20,28,29,30,31 . Ces composants sont essentiels pour assurer la distribution polarisée des protéines BM.
Pour surveiller la localisation intracellulaire des protéines BM dans la FE, des protéines de membrane basale marquées de manière endogène (pièges à protéines), telles que Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) et Perlecan-GFP (Pcan-GFP) peuvent être utilisées32,33. Il a été démontré que ces lignées de pièges protéiques reflètent avec précision la distribution endogène des protéines BM et permettent une détection plus sensible du traficvésiculeux 28,30. Les composants impliqués dans le dépôt polarisé de BM dans le FE ont d’abord été caractérisés à l’aide de raies pièges protéiques pour Vkg-GFP et Pcan-GFP 20,28,29,30. Les pièges à protéines peuvent être utilisés dans différents contextes génétiques, y compris les mutants et les lignées Gal4 34. De plus, les pièges à protéines peuvent être utilisés en combinaison avec des colorants fluorescents et/ou une immunocoloration par fluorescence, ce qui permet une caractérisation précise de la localisation des protéines BM lors de la comparaison des conditions de type sauvage et mutantes35.
Pour évaluer avec précision et efficacité la distribution et la localisation des vésicules contenant des protéines BM, la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et les techniques d’imagerie à super-résolution présentent un avantage significatif par rapport aux autres approches d’imagerie. Ces approches associent l’imagerie haute résolution à une relative facilité d’utilisation. CLSM est une technique de microscopie qui permet d’améliorer la résolution optique en scannant l’échantillon avec un laser de manière raster à l’aide de galvanomètres. L’ouverture du sténopé est un composant central d’un microscope confocal. En bloquant les signaux flous provenant d’au-dessus ou au-dessous du plan focal, l’ouverture du sténopé se traduit par une résolution très supérieure dans l’axe z36. Cela permet également d’obtenir une série d’images dans le plan z, appelée z-stack, correspondant à une série de sections optiques. z-stacks crée ensuite une image 3D du spécimen, via une reconstruction 3D, à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Les microscopes à épifluorescence conventionnels (grand champ), contrairement aux microscopes confocaux, permettent à la lumière floue de contribuer à la qualité de l’image, en diminuant la résolution de l’image et le contraste36,37. Cela fait de la microscopie à épifluorescence un candidat moins attrayant lors de l’étude de la localisation ou de la colocalisation des protéines.
Bien que le CLSM soit une approche appropriée pour diverses applications, y compris l’imagerie et la caractérisation du trafic intracellulaire des protéines BM, il présente toujours un problème lors de l’imagerie d’échantillons en dessous de la limite de diffraction de la lumière d’Abbe (200-250 nm). Lors de l’imagerie de tels échantillons, la microscopie confocale, en particulier lors de l’utilisation d’un objectif d’huile, peut entraîner une haute résolution. Cependant, les techniques de super-résolution dépassent la limite de la microscopie confocale. Il existe différentes approches pour obtenir une microscopie à super-résolution, chacune avec des limites de résolution spécifiques, et chacune appropriée pour différentes analyses. Ces approches comprennent la microscopie de localisation photoactivée (PALM) ou la microscopie à reconstruction optique stochastique (STORM), la microscopie à épuisement par émission stimulée (STED), la microscopie à éclairage structuré (SIM) et la microscopie Airyscan (super-résolution) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Bien qu’Airyscan ait une résolution plus grossière que PALM/STORM, STED et SIM, il peut toujours atteindre une résolution allant jusqu’à ~ 120 nm (environ deux fois la résolution de CLSM). En outre, il a été démontré que cette approche de microscopie à super-résolution présente un avantage sur la carte SIM et d’autres techniques de super-résolution lors de l’imagerie d’échantillons épais et d’échantillons avec un faible rapport signal/bruit47,48.
Airyscan est une technologie de microscopie confocale à super-résolution relativement nouvelle46. Contrairement aux CLSM traditionnels, qui utilisent les détecteurs sténopé et monopoint pour rejeter la lumière floue, cette approche à super-résolution utilise un détecteur de zone de tube photomultiplicateur à 32 canaux de phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP) qui recueille toute la lumière à chaque position de balayage45. Chacun des 32 détecteurs fonctionne comme un petit sténopé, réduisant la taille du sténopé de l’unité aérée (A.U.) traditionnelle de 1,0 à une unité d’AIR améliorée de 0,2 A.U., permettant une résolution et un rapport signal/bruit encore plus élevés, tout en maintenant l’efficacité d’un diamètre de 1,25 A.U.de 45. De plus, la déconvolution linéaire utilisée par Airyscan se traduit par une augmentation jusqu’à 2 fois de la résolution45. Compte tenu de cela, clSM, et en particulier la microscopie à super-résolution, sont bien adaptés pour étudier les protéines BM et les protéines qui régulent le dépôt basal des protéines BM, car ils peuvent produire des images à très haute résolution pour les études de localisation et de colocalisation, fournissant ainsi de nouvelles informations sur les événements spatiaux, temporels et moléculaires qui contrôlent ces processus.
Une autre approche de la microscopie confocale qui peut être utilisée pour effectuer des expériences de localisation est la déconvolution d’image. Étant donné que la microscopie à grand champ permet à la lumière floue d’atteindre les détecteurs, des algorithmes de déconvolution mathématiques et informatiques peuvent être appliqués pour supprimer ou réaffecter la lumière floue des images obtenues par microscopie à grand champ, améliorant ainsi la résolution et le contraste de l’image49. Les algorithmes de déconvolution peuvent également être appliqués aux images confocales pour augmenter encore la résolution et le contraste, produisant des images finales presque comparables à celles de la microscopie à super-résolution50. Airyscan utilise la déconvolution basée sur les filtres Weiner ainsi que la réaffectation des pixels de Sheppard, ce qui se traduit par une résolution spatiale et un rapport signal/bruit considérablement améliorés. Par rapport à la microscopie confocale, une augmentation de 2x de la résolution dans les trois dimensions spatiales (120 nm en x et y, et 350 nm en z) est observée lors de l’utilisation de cette technique de microscopie à super-résolution45,51.
Ce manuscrit fournit des protocoles détaillés et optimisés pour colorer, acquérir et visualiser le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM en utilisant l’EF de l’ovaire de la drosophile comme système modèle couplé à la microscopie confocale et à super-résolution. Les lignées de drosophiles exprimant des protéines de membrane basale marquées de manière endogène, par exemple Vkg-GFP et Pcan-GFP, sont des outils efficaces et précis pour visualiser le trafic et la sécrétion de protéines BM. En outre, ils peuvent être facilement utilisés dans différents contextes génétiques, y compris les lignées mutantes et Gal4 / UAS 34. Bien que les protéines de la membrane basale marquées de manière endogène soient recommandées, l’utilisation d’anticorps contre des protéines BM spécifiques est également compatible avec les protocoles décrits. Ces protocoles sont particulièrement utiles pour les scientifiques qui s’intéressent à l’étude du trafic intracellulaire et de la sécrétion de protéines BM dans les tissus épithéliaux intacts à l’aide de l’imagerie confocale et à super-résolution. De plus, la capacité de combiner l’analyse des tissus épithéliaux avec les outils étendus de la génétique de la drosophile rend cette approche particulièrement puissante. Enfin, ces protocoles pourraient être facilement adaptés pour étudier le trafic vésiculeux et le tri d’autres protéines d’intérêt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

La membrane basale (BM) - une feuille spécialisée de matrice extracellulaire présente du côté basal des cellules épithéliales - est essentielle à l’établissement et au maintien de la morphologie des tissus épithéliaux et de la morphogenèse des organes. De plus, le BM est essentiel pour la modélisation des tissus, servant de plate-forme de signalisation et fournissant des forces externes pour façonner les tissus et les organes. Malgré les nombreux rôles importants que joue le BM au cours du développement normal et des conditions pathologiques, les voies biologiques contrôlant le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la façon dont la sécrétion basale conduit au dépôt polarisé de protéines BM sont mal comprises. L’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile est un excellent système modèle pour étudier le dépôt basal des protéines membranaires BM, car il produit et sécrète tous les principaux composants du BM. L’imagerie confocale et super-résolution combinée au traitement d’images dans des tissus fixes permet l’identification et la caractérisation des facteurs cellulaires spécifiquement impliqués dans le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM. Cet article présente un protocole détaillé pour la coloration et l’imagerie des vésicules contenant du BM et du BM déposé à l’aide de protéines marquées de manière endogène dans l’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile . Ce protocole peut être appliqué pour répondre à des questions qualitatives et quantitatives et il a été développé pour permettre un criblage à haut débit, permettant l’identification rapide et efficace des facteurs impliqués dans le trafic intracellulaire polarisé et la sécrétion de vésicules pendant le développement du tissu épithélial.

Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour imager et caractériser efficacement et avec précision le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines BM dans les cellules épithéliales polarisées, telles que la FE de l’ovaire de la drosophile . Ensuite, nous fournissons les résultats anticipés obtenus à l’aide des méthodes décrites, ainsi que des conseils utiles et des pièges potentiels. Pour ce faire, Vkg-GFP, un Vkg marqué de manière endogène (Drosophila Col IV) es...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

La membrane basale est essentielle à la morphogenèse des tissus et des organes pendant le développement. Pour mieux comprendre les mécanismes conduisant à un placement correct de cette structure, le protocole présenté décrit des méthodes pour visualiser et caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale dans les cellules épithéliales en utilisant la microscopie confocale et super-résolution.

Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Ce protocole permet de caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale en utilisant le réseau de drosophiles comme système modèle. Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet l’imagerie à haute résolution du trafic intracellulaire de protéines de la membrane basale à l’aide de protéines marquées de manière endogène et de la microscopie à super-résolution Airyscan. Bien que ce protocole soit développé pour imager le trafic intracellulaire de protéines de la membrane basale, il peut être étendu pour étudier le trafic d’autres protéines d’intérêt et d’autres systèmes biologiques, y compris la culture cellulaire et les organoïdes.Pour commencer, après avoir disséqué les ovaires de la drosophile dans le PBS sous une lunette de dissection, ajoutez un millilitre de solution de fixation et fixez les ovaires sur une plate-forme de nutation pendant 15 minutes. Retirez la solution de fixation et effectuez deux lavages rapides, chacun avec un millilitre de PBST. En inversant doucement les tubes de microcentrifugation cinq à six fois, puis effectuez quatre longs lavages de 10 minutes chacun avec un millilitre de PBST sur une bascule à plate-forme de nutation.Après avoir effectué la fixation et le lavage, retirez le PBST, puis ajoutez un millilitre de solution bloquante et bloquez les ovaires sur une bascule à plate-forme de nutation pendant au moins une heure. Ensuite, retirez la solution bloquante et ajoutez 300 microlitres de solution d’anticorps primaires, contenant des anticorps primaires dilués à leurs concentrations appropriées dans la solution bloquante. Incuber toute la nuit sur une bascule à plate-forme de nutation à 4 degrés Celsius.Après avoir retiré la solution d’anticorps primaire, effectuez deux lavages rapides et quatre lavages longs, comme démontré précédemment, puis retirez le PBST et ajoutez 500 microlitres de solution d’anticorps secondaires contenant des anticorps secondaires fluorescents qui détecteront les anticorps primaires utilisés. Incuber les ovaires dans la solution d’anticorps secondaire sur une bascule à plate-forme de nutation pendant deux heures à température ambiante, puis effectuer deux lavages rapides et quatre lavages longs en PBST comme démontré précédemment sur une bascule de plate-forme de nutation. Après le dernier lavage, utilisez une pipette P-1000 pour pipeter doucement les ovaires de haut en bas dans le tube afin de séparer les chambres à œufs.Laissez les chambres à œufs couler au fond en maintenant le tube en position verticale pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, retirez le PBST à l’aide d’une pipette Pasteur, en laissant environ 50 microlitres. Ensuite, retirez autant que possible le PBST restant à l’aide d’une pipette P-200 et ajoutez deux gouttes de support de montage, suffisamment pour répartir uniformément sur un couvercle.Pour faciliter le transfert du support de montage visqueux vers la glissière à partir du tube de microcentrifugation, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P-200. Ensuite, transférez lentement toutes les chambres à œufs du support de montage sur la lame de verre, en veillant à ne pas créer de bulles. Sous un microscope à dissection, étalez doucement le support de montage et séparez les chambres à œufs à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette P-200 ou d’une pince pour couvrir une zone de la taille d’un glissement de couverture.À l’aide d’une pince, placez soigneusement le couvercle sur les chambres à œufs en angle pour éviter les bulles et stockez la lame à température ambiante sur une surface plane dans l’obscurité pendant deux jours pour polymériser. Une fois le support de montage durci, la lame peut être stockée à 4 degrés Celsius dans l’obscurité pendant quelques semaines pour l’imagerie. Pour visualiser la localisation intracellulaire des protéines de la membrane basale, réglez l’objectif sur 63x et placez doucement une goutte d’huile d’immersion sur sa lentille, puis positionnez la glissière sur l’objectif avec le couvercle orienté vers l’objectif pour localiser l’échantillon.Localisez la région d’intérêt à l’aide de l’oculaire du microscope épifluorescent, puis sélectionnez une configuration avec les paramètres appropriés pour les fluorophores à imager comme décrit dans le manuscrit. Une fois la configuration définie, imagez l’échantillon en sélectionnant Live sous Mode d’acquisition et ajustez le zoom entre 2 et 4x pour optimiser la zone de numérisation de l’échantillon. Pour chaque chaîne individuelle, sélectionnez une piste sous Chaîne et cliquez sur Live.Ajustez le gain principal et la puissance laser lors de l’utilisation de l’outil indicateur de portée et suivez toutes les directives pour éviter les pixels saturés comme décrit dans le manuscrit, tout en répétant la même chose pour chaque canal. Dans la fenêtre bascule Mode d’acquisition, sous Taille de l’image, cliquez sur SR pour maximiser les capacités du détecteur et ajuster automatiquement la taille de l’image. Gardez la moyenne à Aucun en mode Airyscan car elle n’est généralement pas nécessaire et réduira le temps d’analyse.Cependant, dans certains cas, une moyenne de 2x peut améliorer le rapport signal/bruit, puis cliquez sur Snap pour acquérir une image. Pour acquérir une pile Z, cochez la case Z-Stack sous l’onglet Acquisition. Ensuite, sélectionnez le canal souhaité pour observer le spécimen.Par exemple, le canal DAPI et cliquez sur Live pour lancer une numérisation en direct, puis définissez une plage pour la pile Z à l’aide du bouton de réglage fin du microscope. Ensuite, définissez les points de terminaison de la pile Z en cliquant sur Définir en premier et Définir en dernier. Pour une reconstruction 3D optimale, définissez l’intervalle pour la pile Z inférieur à 0,5 micromètre pour attribuer la taille de l’étape et cliquez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition de la pile Z.Une fois les images ou la pile Z obtenues, cliquez sur l’option Traitement, puis sur Méthode et sélectionnez Traitement Airyscan. Effectuez un filtre automatique pour démarrer et, si nécessaire, effectuez un traitement manuel supplémentaire en modifiant la valeur de super résolution pour obtenir les meilleurs résultats pour l’échantillon. Une fois la valeur SR optimale déterminée, cliquez sur Appliquer pour générer une image traitée.Dans le cas des images Z-stack, traitez soit comme une tranche Z, soit comme l’ensemble de la pile Z en cliquant sur la case Traitement 3D. Pour visualiser le trafic de protéines en 3D après l’acquisition d’une pile Z, générez une image 3D en cliquant sur l’icône 3D dans la fenêtre d’aperçu, qui apparaîtra dans la section de contrôle d’affichage de l’image traitée Airyscan. Parmi les différentes options de vue 3D, utilisez les vues Surface ou Mixte lors de l’affichage de la structure des vésicules.Pour une image de la plus haute qualité, sélectionnez le paramètre Précis car le paramètre le plus rapide sera moins précis et entraînera un mauvais rendu 3D. Une fois l’image générée, manipulez l’image 3D en zoomant et en la faisant pivoter pour faire la mise au point sur un emplacement préféré. Une fois la vue obtenue, sous l’onglet 3D, sélectionnez Résolution affichée, puis cliquez sur Créer une image, qui créera un instantané de l’image dans la même orientation que celle affichée et pourra être enregistré et exporté dans différents formats de fichier.La microscopie confocale peut être utilisée pour visualiser la localisation intracellulaire et le dépôt de protéines de la membrane basale telles que Viking-GFP lorsque les paramètres d’acquisition sont optimisés. Lorsque l’acquisition et le traitement de l’image sont effectués correctement, la microscopie à super-résolution augmente la résolution de l’image par rapport à la microscopie confocale. Comme l’illustrent les images mieux définies dans le trafic intracellulaire de protéines de la membrane basale, telles que Viking.La projection orthogonale permet de visualiser la distribution globale des vésicules et des compartiments contenant des protéines de la membrane basale dans une seule image à l’aide d’une imagerie confocale ou à super-résolution. Une reconstruction 3D par assemblage d’une pile de sections optiques en Z prises par imagerie confocale ou à super-résolution a été utilisée pour évaluer la localisation et la distribution des protéines de la membrane basale intracellulaire. L’imagerie à super-résolution peut être utilisée pour déterminer la localisation précise des protéines de la membrane basale dans des conditions mutantes.Par exemple, dans les cellules épithéliales de Crag knockdown, les protéines de la membrane basale s’accumulent à la fois par voie apicale et basale, ce qui indique qu’elles contrôlent la sécrétion polarisée des protéines de la membrane basale. La microscopie confocale et la microscopie à super-résolution peuvent également être utilisées dans des expériences de colocalisation. Par exemple, cette figure montre la colocalisation partielle de Viking-GFP et d’un marqueur de Golgi, GM-130, confirmant que Viking est trié dans le Golgi avant la sécrétion.Pour imager efficacement le trafic de protéines de la membrane basale à l’aide de la microscopie à super-résolution, nous recommandons de monter soigneusement les ovaires et d’accorder une attention particulière lors du réglage des paramètres d’acquisition et de convolution. Ce protocole est optimisé pour visualiser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale. Cependant, il peut être facilement modifié pour imager efficacement le trafic d’autres protéines d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Recherche

Biologie du développement

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Le c. elegans Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et sécrétion

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Utilisation de la microscopie d’expansion pour agrandir physiquement des embryons de drosophile entiers pour l’imagerie à super-résolution

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...