Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

पांडुलिपि पर उनकी उपयोगी टिप्पणियों के लिए लेखक जूली मर्कल के आभारी हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान आर 15 जीएम 137236 से ओडी द्वारा समर्थित किया गया था। कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को एयरिस्कैन 2 के साथ ज़ीस एलएसएम 900 का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था, जिसे एनएसएफ एमआरआई अनुदान 2018748 के साथ खरीदा गया था।

1. अंडाशय विच्छेदन के लिए मक्खी तैयारी
<ol><li>वांछित जीनोटाइप के 10-15 ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मादा मक्खियों (1-2 दिन पुराना) को एक संकीर्ण शीशी में रखें जिसमें ~ 8 एमएल ड्रोसोफिला फ्लाई मीडियम होत?...

बीएम भ्रूण और अंग मॉर्फोजेनेसिस, और वयस्क शारीरिक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएम उपकला ध्रुवीयता की स्थापना और रखरखाव के लिए एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में कार्य करता है और ऊतकों क...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

तहखाने झिल्ली (बीएम) - उपकला कोशिकाओं के बेसल पक्ष में मौजूद बाह्य मैट्रिक्स की एक विशेष शीट - उपकला ऊतक आकृति विज्ञान और अंग आकृति जनन की स्थापना और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएम ऊतक मॉडलिंग के लिए आवश्यक है, एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा करता है, और ऊतकों और अंगों को आकार देने के लिए बाहरी बल प्रदान करता है। सामान्य विकास और रोग स्थितियों के दौरान बीएम द्वारा निभाई जाने वाली कई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के बावजूद, बीएम युक्त पुटिकाओं के इंट्रासेल्युलर तस्करी को नियंत्रित करने वाले जैविक मार्ग और बेसल स्राव बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत जमाव की ओर कैसे जाता है, खराब समझा जाता है। ड्रोसोफिला अंडाशय का कूपिक उपकला बीएम झिल्ली प्रोटीन के बेसल जमाव का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है, क्योंकि यह बीएम के सभी प्रमुख घटकों का उत्पादन और स्राव करता है निश्चित ऊतकों में छवि प्रसंस्करण के साथ संयुक्त कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग विशेष रूप से बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और जमाव में शामिल सेलुलर कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। यह लेख धुंधला और इमेजिंग बीएम युक्त पुटिकाओं के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और ड्रोसोफिला अंडाशय के कूपिक उपकला में अंतर्जात टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करके बीएम जमा करता है। इस प्रोटोकॉल को गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों प्रश्नों को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है और इसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को समायोजित करने के लिए विकसित किया गया था, जिससे ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और उपकला ऊतक विकास के दौरान पुटिकाओं के स्राव में शामिल कारकों की तेजी से और कुशल पहचान की अनुमति मिलती है।

यहां वर्णित विधियों का उपयोग कुशलतापूर्वक और सटीक रूप से छवि बनाने और ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि ...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

विकास के दौरान ऊतक और अंग आकृतिजनन के लिए तहखाने की झिल्ली आवश्यक है। इस संरचना के उचित प्लेसमेंट के लिए अग्रणी तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं में तहखाने झिल्ली प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर तस्करी और स्राव की कल्पना और लक्षण वर्णन करने के तरीकों का वर्णन करता है।

ड्रोसोफिला ओजेनेसिस के दौरान ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और बेसमेंट मेम्ब्रेन प्रोटीन के स्राव के कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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सी. एलिगेंस निकालनेवाला नहर Intracellular लुमेन Morphogenesis के लिए एक मॉडल के रूप में और Vivo में एक एकल कक्ष में ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति: लेबलिंग द्वारा GFP-फ्यूजन, RNAi इंटरेक्शन स्क्रीन और इमेजिंग

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