Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Gli autori sono grati a Julie Merkle per i suoi utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R15GM137236 a O.D. Le immagini confocali e super-risoluzioni sono state acquisite utilizzando uno Zeiss LSM 900 con Airyscan 2, acquistato con 2018748 di sovvenzione NSF MRI.

1. Preparazione della mosca per le dissezioni ovariche
<ol><li>Mettere 10-15 mosche femmine di Drosophila melanogaster (1-2 giorni) del genotipo desiderato in una fiala stretta contenente ~ 8 mL di Drosophila fly medium cosparsa con una piccola quantità di lievito di birra granulato 2-3 giorni prima della dissezione a 25 °C. L'aggiunta di alcuni maschi alla fiala può aumentare la resa della camera delle uova. Tuttavia, assicurarsi che il numero totale di mosche non superi 20 in qu...

Il BM è fondamentale per la morfogenesi embrionale e d'organo e per le funzioni fisiologiche dell'adulto. Inoltre, il BM funge da piattaforma di segnalazione per l'istituzione e il mantenimento della polarità epiteliale e fornisce ai tessuti supporto2. Tuttavia, i meccanismi che regolano il corretto posizionamento delle proteine BM sono poco conosciuti. Una migliore comprensione dei percorsi biologici dedicati al traffico intracellulare e alla secrezione polarizzata delle proteine BM richiede un...

La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi1. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti 1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cui la separazione e la barriera dei tessuti, la crescita e il supporto e la polarizzazione cellulare 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Il suo ruolo di piattaforma di segnalazione regola la morfologia e la differenziazione delle cellule epiteliali e dei tessuti durante lo sviluppo 3,13,14. Inoltre, l'errata regolazione del BM e/o una violazione della sua integrità sono le cause primarie di molte condizioni patologiche, tra cui le metastasi tumorali 2,15,16. Nonostante le funzioni essenziali svolte dal BM durante la morfogenesi tissutale e d'organo, i componenti delle vie biologiche dedicate al traffico intracellulare polarizzato e alla secrezione di proteine BM sono vagamente note.
Per studiare il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e la secrezione di proteine BM da parte delle cellule epiteliali, l'epitelio follicolare (FE) dell'ovaio Drosophila è un potente sistema modello (Figura 1). Un'ovaia di Drosophila comprende 16-20 strutture lunghe simili a tubi, chiamate ovarioli (Figura 1A,B)17,18,19. Ogni ovariole può essere pensato come una catena di montaggio dell'uovo, con la progressione dell'età delle camere dell'uovo (che danno origine a ciascuna un uovo) che inizia all'estremità anteriore e si muove posteriormente, fino a quando l'uovo maturo esce attraverso l'ovidotto. Ogni camera uovo è incapsulata dal FE, un monostrato di cellule follicolari somatiche (FC), che circonda le cellule germinali centrali (GC). Il FE è altamente polarizzato con una distinta polarità apicale-basale in cui il dominio apicale è rivolto verso la linea germinale e le proteine BM sono secrete basalmente18,19. I FC secernono attivamente tutti i principali componenti del BM, tra cui Collagen IV, Perlecan e Laminins 20,21. Nelle cellule epiteliali come le FC, i componenti BM sono prodotti e richiedono una via di secrezione polarizzata specializzata per la loro deposizione extracellulare. Ad esempio, nel caso del componente più abbondante del BM, collagene IV (Coll IV), i dettagli che circondano il suo traffico intracellulare polarizzato e la secrezione sono vaghi nonostante la sua produzione e deposizione siano al centro di molti studi. Coll IV è tradotto nel reticolo endoplasmatico (ER), che è anche dove ogni fibrilla - composta da tre polipeptidi (due catene α1 e una catena α2) - è assemblata in una tripla elica22. Il corretto ripiegamento e funzione di Coll IV richiedono chaperoni ed enzimi ER, tra cui lisil e prolil-idrossilasi come Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Questi enzimi post-traduzionali regolano lo smistamento ER di Coll IV, poiché la perdita di ciascuno fa sì che Coll IV sia intrappolato nell'ER basale 20,23,24,25,26. Quindi, il Coll IV appena sintetizzato esce dal pronto soccorso per il Golgi in vescicole rivestite copiose. Il recettore di carico Tango1 aiuta a confezionare i collageni in vescicole legate al Golgi di grandi dimensioni che possono ospitare grandi proteine multimeriche20,27. Una volta che Coll IV è confezionato in vescicole esocitiche intracellulari, viene specificamente secreto basalmente dalle cellule epiteliali. Per dirigere la deposizione di BM sul lato basale, le cellule epiteliali richiedono un altro insieme di fattori specificamente dedicati alla secrezione di BM polarizzata. Utilizzando il FE dell'ovaio Drosophila, sono stati caratterizzati alcuni componenti di questo nuovo processo cellulare, tra cui i fattori di scambio nucleotidico (GEF) Crag e Stratum, le GTPasi Rab8 e Rab10, nonché i livelli del fosfoinositide PI(4,5)P2 e le proteine motorie Kinesin 1 e 3 20,28,29,30,31 . Questi componenti sono fondamentali per garantire la distribuzione polarizzata delle proteine BM.
Per monitorare la localizzazione intracellulare delle proteine BM nella FE, possono essere utilizzate proteine di membrana basale endogenamente marcate (trappole proteiche), come Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. Queste linee di trappola proteica hanno dimostrato di riflettere accuratamente la distribuzione endogena delle proteine BM e consentono un rilevamento più sensibile del traffico vescicolare28,30. I componenti coinvolti nella deposizione polarizzata di BM nel FE sono stati inizialmente caratterizzati utilizzando linee di trappola proteica per Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Le trappole proteiche possono essere utilizzate in diversi background genetici, compresi i mutanti e le linee Gal4 34. Inoltre, le trappole proteiche possono essere utilizzate in combinazione con coloranti fluorescenti e/o immunocolorazione a fluorescenza, consentendo una caratterizzazione precisa della localizzazione delle proteine BM quando si confrontano le condizioni wild-type e mutanti35.
Per valutare in modo accurato ed efficiente la distribuzione e la localizzazione delle vescicole contenenti proteine BM, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e le tecniche di imaging a super-risoluzione presentano un vantaggio significativo rispetto ad altri approcci di imaging. Questi approcci accoppiano l'imaging ad alta risoluzione con una relativa facilità d'uso. CLSM è una tecnica di microscopia che consente una migliore risoluzione ottica scansionando il campione con un laser in modo raster utilizzando galvanometri. L'apertura stenopeica è un componente fondamentale di un microscopio confocale. Bloccando i segnali fuori fuoco provenienti da sopra o sotto il piano focale, l'apertura stenopeica si traduce in una risoluzione altamente superiore nell'asse z36. Ciò consente anche di ottenere una serie di immagini nel piano z, chiamato z-stack, corrispondente a una serie di sezioni ottiche. Z-stacks crea successivamente un'immagine 3D del campione, tramite ricostruzione 3D, con l'ausilio di software di imaging. I microscopi a epifluorescenza (widefield) convenzionali, a differenza dei microscopi confocali, consentono alla luce sfocata di contribuire alla qualità dell'immagine, diminuendo la risoluzione dell'immagine e il contrasto36,37. Ciò rende la microscopia a epifluorescenza un candidato meno attraente quando si studia la localizzazione o la colocalizzazione delle proteine.
Sebbene CLSM sia un approccio adatto per varie applicazioni, tra cui l'imaging e la caratterizzazione del traffico intracellulare di proteine BM, presenta ancora un problema quando si visualizzano campioni al di sotto del limite di diffrazione della luce di Abbe (200-250 nm). Quando si esegue l'imaging di tali campioni, la microscopia confocale, specialmente quando si utilizza un obiettivo ad olio, può portare ad un'alta risoluzione. Tuttavia, le tecniche di super-risoluzione superano il limite della microscopia confocale. Esistono vari approcci per ottenere la microscopia a super-risoluzione, ognuno con limiti di risoluzione specifici e ciascuno appropriato per analisi diverse. Questi approcci includono microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) o microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM), microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e microscopia Airyscan (super-risoluzione) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Sebbene Airyscan abbia una risoluzione più grossolana di PALM / STORM, STED e SIM, può comunque raggiungere una risoluzione fino a ~ 120 nm (circa il doppio della risoluzione di CLSM). Inoltre, questo approccio di microscopia a super-risoluzione ha dimostrato di avere un vantaggio rispetto alla SIM e ad altre tecniche di super-risoluzione quando si visualizzano campioni spessi e campioni con un basso rapporto segnale-rumore47,48.
Airyscan è una tecnologia di microscopia confocale a super-risoluzione relativamente nuova46. A differenza dei CLSM tradizionali, che utilizzano i rilevatori stenopeici e a punto singolo per respingere la luce fuori fuoco, questo approccio a super-risoluzione utilizza un rilevatore di area del tubo fotomoltiplicatore a 32 canali di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP) che raccoglie tutta la luce in ogni posizione di scansione45. Ciascuno dei 32 rivelatori funziona come un piccolo foro stenopeico, riducendo le dimensioni del foro stenopeico dalla tradizionale 1.0 Airy Unit (A.U.) a una maggiore 0.2 A.U., consentendo una risoluzione e un rapporto segnale-rumore ancora più elevati, pur mantenendo l'efficienza di un diametro 1.25 A.U.45. Inoltre, la deconvoluzione lineare utilizzata da Airyscan si traduce in un aumento fino a 2 volte della risoluzione45. Tenendo conto di ciò, i CLSM, e in particolare la microscopia a super-risoluzione, sono adatti per studiare le proteine BM e le proteine che regolano la deposizione basale delle proteine BM, in quanto possono produrre immagini ad altissima risoluzione per studi di localizzazione e colocalizzazione, fornendo così nuove intuizioni sugli eventi spaziali, temporali e molecolari che controllano questi processi.
Un approccio alternativo alla microscopia confocale che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di localizzazione è la deconvoluzione delle immagini. Poiché la microscopia a largo campo consente alla luce fuori fuoco di raggiungere i rivelatori, è possibile applicare algoritmi di deconvoluzione matematica e computazionale per rimuovere o riassegnare la luce fuori fuoco dalle immagini ottenute con la microscopia a campo largo, migliorando così la risoluzione e il contrasto dell'immagine49. Gli algoritmi di deconvoluzione possono essere applicati anche alle immagini confocali per aumentare ulteriormente la risoluzione e il contrasto, producendo immagini finali quasi paragonabili a quelle della microscopia a super-risoluzione50. Airyscan utilizza la deconvoluzione basata sul filtro Weiner insieme alla riassegnazione dei pixel di Sheppard, con conseguente miglioramento della risoluzione spaziale e del rapporto segnale-rumore. Rispetto alla microscopia confocale, si osserva un aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e tre le dimensioni spaziali (120 nm in x e y e 350 nm in z) quando si utilizza questa tecnica di microscopia a super-risoluzione 45,51.
Questo manoscritto fornisce protocolli dettagliati e ottimizzati per macchiare, acquisire e visualizzare il traffico intracellulare e la deposizione di proteine BM utilizzando il FE dell'ovaio Drosophila come sistema modello accoppiato con microscopia confocale e super-risoluzione. Le linee di Drosophila che esprimono proteine di membrana basale endogenamente etichettate, ad esempio Vkg-GFP e Pcan-GFP, sono strumenti efficienti e accurati per visualizzare il traffico e la secrezione di proteine BM. Inoltre, possono essere facilmente utilizzati in diversi background genetici, tra cui mutanti e Gal4 / UAS linee34. Sebbene si raccomandino proteine di membrana basale marcate endogenamente, l'uso di anticorpi contro specifiche proteine BM è anche compatibile con i protocolli descritti. Questi protocolli sono particolarmente utili per gli scienziati interessati a studiare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel tessuto epiteliale intatto utilizzando l'imaging confocale e super-risoluzione. Inoltre, la capacità di combinare l'analisi del tessuto epiteliale con gli strumenti espansivi della genetica Drosophila rende questo approccio particolarmente potente. Infine, questi protocolli potrebbero essere facilmente adattati per studiare il traffico vescicolare e lo smistamento di altre proteine di interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

La membrana basale (BM) - un foglio specializzato di matrice extracellulare presente sul lato basale delle cellule epiteliali - è fondamentale per l'istituzione e il mantenimento della morfologia del tessuto epiteliale e della morfogenesi degli organi. Inoltre, il BM è essenziale per la modellazione dei tessuti, fungendo da piattaforma di segnalazione e fornendo forze esterne per modellare tessuti e organi. Nonostante i molti ruoli importanti che il BM svolge durante il normale sviluppo e le condizioni patologiche, le vie biologiche che controllano il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e come la secrezione basale porta alla deposizione polarizzata delle proteine BM sono scarsamente comprese. L'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila è un eccellente sistema modello per studiare la deposizione basale delle proteine di membrana BM, in quanto produce e secerne tutti i principali componenti del BM. L'imaging confocale e a super-risoluzione combinato con l'elaborazione delle immagini in tessuti fissi consente l'identificazione e la caratterizzazione di fattori cellulari specificamente coinvolti nel traffico intracellulare e nella deposizione di proteine BM. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la colorazione e l'imaging di vescicole contenenti BM e BM depositato utilizzando proteine marcate endogenamente nell'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila . Questo protocollo può essere applicato per affrontare questioni sia qualitative che quantitative ed è stato sviluppato per ospitare lo screening ad alto rendimento, consentendo l'identificazione rapida ed efficiente dei fattori coinvolti nel traffico intracellulare polarizzato e nella secrezione di vescicole durante lo sviluppo del tessuto epiteliale.

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare e caratterizzare in modo efficiente e accurato il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in cellule epiteliali polarizzate, come la FE dell'ovaio Drosophila . Successivamente, forniamo i risultati attesi ottenuti utilizzando i metodi descritti, nonché consigli utili e potenziali insidie. Per fare ciò, viene utilizzato Vkg-GFP, un Vkg endogenamente taggato (Drosophila Col IV). Tuttavia, gli stessi risultati possono essere...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico intracellulare e della secrezione di proteine di membrana basale utilizzando l'array Drosophila come sistema modello. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che consente l'imaging ad alta risoluzione del traffico intracellulare di proteine della membrana basale utilizzando proteine marcate endogenamente e microscopia a super-risoluzione Airyscan. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per visualizzare il traffico intracellulare delle proteine della membrana basale, può essere esteso per studiare il traffico di altre proteine di interesse e altri sistemi biologici, tra cui colture cellulari e organoidi.Per iniziare, dopo aver sezionato le ovaie di Drosophila in PBS sotto un ambito di dissezione, aggiungere un millilitro di soluzione di fissazione e fissare le ovaie su una piattaforma di nutating per 15 minuti. Rimuovere la soluzione di fissaggio ed eseguire due lavaggi rapidi, ciascuno con un millilitro di PBST. Invertendo delicatamente i tubi della microcentrifuga da cinque a sei volte, quindi eseguire quattro lunghi lavaggi di 10 minuti ciascuno con un millilitro di PBST su un bilanciere a piattaforma nutating.Dopo aver eseguito la fissazione e il lavaggio, rimuovere PBST, quindi aggiungere un millilitro di soluzione bloccante e bloccare le ovaie su un bilanciere a piattaforma nutating per un minimo di un'ora. Quindi, rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale primaria, contenenti anticorpi primari diluiti alle loro concentrazioni appropriate in soluzione bloccante. Incubare durante la notte su un bilanciere a piattaforma nutating a 4 gradi Celsius.Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale primaria, eseguire due lavaggi rapidi e quattro lavaggi lunghi, come dimostrato in precedenza, quindi rimuovere PBST e aggiungere 500 microlitri di soluzione anticorpale secondaria contenente anticorpi secondari fluorescenti che rileveranno gli anticorpi primari utilizzati. Incubare le ovaie nella soluzione anticorpale secondaria su un bilanciere a piattaforma nutating per due ore a temperatura ambiente, quindi eseguire due lavaggi rapidi e quattro lunghi lavaggi in PBST come dimostrato in precedenza su un bilanciere a piattaforma nutating. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta P-1000 per pipettare delicatamente le ovaie su e giù nel tubo per separare le camere delle uova.Lasciare che le camere delle uova affondino sul fondo mantenendo il tubo in posizione verticale per cinque o 10 minuti. Quindi, rimuovere PBST utilizzando una pipetta Pasteur, lasciando circa 50 microlitri. Successivamente, rimuovere il più possibile il PBST rimanente utilizzando una pipetta P-200 e aggiungere due gocce di mezzo di montaggio, sufficienti per distribuire uniformemente su uno slittamento di copertura.Per consentire un facile trasferimento del mezzo di montaggio viscoso alla slitta dal tubo microcentrifuga, tagliare l'estremità di una punta della pipetta P-200. Quindi, trasferire lentamente tutte le camere delle uova nel mezzo di montaggio sul vetrino, assicurandosi di non creare bolle. Sotto un microscopio di dissezione, stendere delicatamente il supporto di montaggio e separare le camere delle uova utilizzando una nuova punta o pinza per pipetta P-200 per coprire un'area delle dimensioni di una slitta di copertura.Usando la pinza, posizionare con attenzione il coperchio scivolare sulle camere delle uova ad angolo per evitare bolle e conservare il vetrino a temperatura ambiente su una superficie piana al buio per due giorni per polimerizzare. Una volta che il supporto di montaggio è indurito, il vetrino può essere conservato a 4 gradi Celsius al buio per alcune settimane per l'imaging. Per visualizzare la localizzazione intracellulare delle proteine della membrana basale, impostare l'obiettivo su 63x e posizionare delicatamente una goccia di olio per immersione sulla lente, quindi posizionare la diapositiva sull'obiettivo con lo slittamento di copertura rivolto verso l'obiettivo per localizzare il campione.Individuare la regione di interesse utilizzando l'oculare del microscopio epifluorescente, quindi selezionare una configurazione con impostazioni appropriate per l'immagine dei fluorofori come descritto nel manoscritto. Una volta impostata la configurazione, visualizzare l'immagine del campione selezionando Live in modalità di acquisizione e regolare lo zoom tra 2 e 4x per ottimizzare l'area di scansione del campione. Per ogni singolo canale, seleziona una traccia sotto Canale e fai clic su Live.Regola il guadagno principale e la potenza del laser mentre usi lo strumento indicatore di gamma e segui tutte le linee guida per evitare pixel saturi come descritto nel manoscritto, ripetendo lo stesso per ogni canale. Nella finestra di commutazione modalità di acquisizione, in Dimensioni immagine, fare clic su SR per massimizzare le capacità del rilevatore e regolare automaticamente le dimensioni del fotogramma. Mantenere la media su Nessuno in modalità Airyscan in quanto di solito non è necessaria e ridurrà il tempo di scansione.Tuttavia, in alcuni casi, una media di 2x può migliorare il rapporto segnale-rumore, quindi fare clic su Snap per acquisire un'immagine. Per acquisire uno Z-stack, fare clic sulla casella di controllo Z-Stack nella scheda Acquisizione. Quindi, selezionare il canale desiderato per osservare il campione.Ad esempio, il canale DAPI e fare clic su Live per avviare una scansione dal vivo, quindi impostare un intervallo per lo Z-stack utilizzando la manopola di regolazione fine sul microscopio. Successivamente, impostare i punti finali dello stack Z facendo clic su Imposta prima e Imposta ultimo. Per una ricostruzione 3D ottimale, impostare l'intervallo per lo Z-stack inferiore a 0,5 micrometri per assegnare la dimensione del passo e fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione dello stack Z.Una volta ottenute le immagini o Z-stack, fare clic sull'opzione Elaborazione, quindi metodo e selezionare Elaborazione Airyscan. Eseguire il filtro automatico per avviare e, se necessario, eseguire un'ulteriore elaborazione manuale modificando il valore di super risoluzione per ottenere i migliori risultati per il campione. Dopo aver determinato il valore SR ottimale, fare clic su Applica per generare un'immagine elaborata.Nel caso di immagini Z-stack, elaborare come una Z-slice o come l'intero Z-stack facendo clic sulla casella Elaborazione 3D. Per visualizzare il traffico proteico in 3D dopo l'acquisizione di uno Z-stack, generare un'immagine 3D facendo clic sull'icona 3D nella finestra di anteprima, che apparirà nella sezione di controllo del display dell'immagine elaborata airyscan. Dalle diverse opzioni di visualizzazione 3D, utilizzate viste superficie o viste miste quando visualizzate la struttura delle vescicole.Per un'immagine di qualità superiore, selezionare l'impostazione Precisa poiché l'impostazione Più veloce sarà meno accurata e porterà a un rendering 3D scadente. Una volta generata l'immagine, manipola l'immagine 3D ingrandendola e ruotandola per mettere a fuoco una posizione preferita. Dopo aver ottenuto la vista, nella scheda 3D selezionare Risoluzione visualizzata, quindi fare clic su Crea immagine, che creerà un'istantanea dell'immagine nello stesso orientamento in cui è stata visualizzata e può essere salvata ed esportata in vari formati di file.La microscopia confocale può essere utilizzata per visualizzare la localizzazione intracellulare e la deposizione di proteine di membrana basale come Viking-GFP quando i parametri di acquisizione sono ottimizzati. Quando l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini vengono eseguite correttamente, la microscopia a super-risoluzione aumenta la risoluzione dell'immagine rispetto alla microscopia confocale. Come illustrato dalle immagini meglio definite nel traffico intracellulare di proteine della membrana basale, come Viking.La proiezione ortogonale consente la visualizzazione della distribuzione complessiva di vescicole e compartimenti contenenti proteine della membrana basale in un'unica immagine utilizzando immagini confocali o a super-risoluzione. Una ricostruzione 3D assemblando una pila di sezioni Z ottiche prelevate mediante imaging confocale o super-risoluzione è stata impiegata per valutare la localizzazione e la distribuzione delle proteine della membrana basale intracellulare. L'imaging a super-risoluzione può essere utilizzato per determinare la localizzazione precisa delle proteine della membrana basale in condizioni mutanti.Ad esempio, nelle cellule epiteliali di Crag knockdown, le proteine della membrana basale si accumulano sia apicalmente che basalmente, indicando che controlla la secrezione polarizzata delle proteine della membrana basale. La microscopia confocale e a super-risoluzione può anche essere impiegata in esperimenti di co-localizzazione. Ad esempio, questa figura mostra la co-localizzazione parziale di Viking-GFP e un marcatore Di Golgi, GM-130, confermando che Viking è ordinato al Golgi prima della secrezione.Per visualizzare in modo efficiente il traffico di proteine di membrana basale utilizzando la microscopia a super-risoluzione, si consiglia di montare con attenzione le ovaie e prestare particolare attenzione quando si impostano i parametri di acquisizione e convoluzione. Questo protocollo è ottimizzato per visualizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale. Tuttavia, può essere facilmente modificato per visualizzare in modo efficiente il traffico di altre proteine di interesse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per l'imaging a super-risoluzione

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...