Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

著者は、原稿に関する彼女の有益なコメントのためにジュリー・マークルに感謝しています。この研究は、NIHの助成金R15GM137236からO.D.への支援を受けた。共焦点および超解像画像は、NSF MRIグラント2018748で購入したAiryscan 2を搭載したツァイスLSM 900を使用して取得されました。

1.卵巣解剖のためのハエの準備
<ol><li>25°Cでの解剖の2〜3日前に少量の粒状パン酵母を振りかけた〜8mLのショウジョウバエ培地を含む狭いバイアルに、所望の遺伝子型の10〜15匹のショウジョウバエメラノガスター雌ハエ(1〜2日齢)を入れる。 バイアルに数人の男性を加えると、卵室の収量を増やすことができます。ただし、ハエの総数が20を超えないようにしてくだ?...

BMは、胚および器官の形態形成、ならびに成人の生理学的機能にとって重要である。さらに、BMは、上皮極性の確立および維持のためのシグナル伝達プラットフォームとして機能し、組織に支持体2を提供する。しかし、BMタンパク質の適切な配置を調節するメカニズムはほとんど理解されていない。BMタンパク質の細胞内輸送および分極分泌に特化した生物学的経路をよりよ?...

基底膜(BM)は、上皮構造および形態形成に重要な層状細胞付着性細胞外マトリックス(ECM)の薄いシートである1。それは〜50のタンパク質を含み、上皮および内皮細胞の根底にある遍在的に見出され、そして骨格、平滑、および心筋細胞および脂肪細胞を包み込む1,2,3。上皮細胞の基底側にあるBMの3つの主要成分は、コラーゲンIV、ペルレカン、およびラミニンである。BMは上皮細胞の根底にあり、組織の分離と障壁、成長と支持、細胞分極2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12を含む多くの機能を担当しています。.シグナル伝達プラットフォームとしてのその役割は、発生中の上皮細胞および組織の形態および分化を調節する3、13、14。さらに、BMの誤った調節および/またはその完全性の侵害は、腫瘍転移を含む多くの病理学的状態の主な原因である2,15,16。組織および器官の形態形成中にBMによって実行される本質的な機能にもかかわらず、BMタンパク質の分極細胞内輸送および分泌に捧げられた生物学的経路の構成要素は漠然と知られている。
BM含有小胞の細胞内輸送および上皮細胞によるBMタンパク質の分泌を研究するために、ショウジョウバエ卵巣の濾胞上皮(FE)は強力なモデル系である(図1)。ショウジョウバエの卵巣は、卵巣と呼ばれる16〜20個の長い管状の構造を含む(図1A、B)17、18、19。各卵巣は卵組立ラインと考えることができ、成熟した卵が卵管を通って出るまで、前端から始まり後方に移動する卵室(それぞれが卵を生じる)の年齢進行を伴う。各卵室は、中央生殖細胞系列細胞(GC)を囲む体細胞卵胞細胞(FC)の単層であるFEによってカプセル化されている。FEは、頂端ドメインが生殖細胞系列に面し、BMタンパク質が基底的に分泌される明確な頂端 - 基底極性で高度に分極している18,19。FCは、コラーゲンIV、ペルレカン、ラミニン20,21を含むBMの主要成分のすべてを積極的に分泌します。FCなどの上皮細胞では、BM成分が産生され、細胞外に沈着するために特殊な分極分泌経路を必要とする。例えば、BMの最も豊富な成分であるコラーゲンIV(Coll IV)の場合、その産生および沈着が多くの研究の焦点であるにもかかわらず、その分極した細胞内輸送および分泌を取り巻く詳細は曖昧である。コルIVは小胞体(ER)に翻訳され、ここでも各線維−3つのポリペプチド(2つのα1鎖および1つのα2鎖)からなる−が三重らせん22に組み立てられる。適切なコルIVの折り畳みおよび機能には、PlodおよびPH4αEFB20、22、23、24、25、26などのリジルおよびプロリルヒドロキシラーゼを含むERシャペロンおよび酵素が必要である。これらの翻訳後酵素は、それぞれの喪失がコルIVを基底ER 20、23、24、25、26に捕捉させるので、コルIVのER選別を調節する。次いで、新たに合成されたコルIVは、COPII被覆小胞においてゴルジ体に対するERを出る。貨物受容体Tango1は、コラーゲンを大きな多量体タンパク質を収容できる大きなゴルジ結合小胞に包装するのに役立ちます20,27。Coll IVが細胞内外膠細胞小胞にパッケージ化されると、上皮細胞から基底的に特異的に分泌される。BM沈着を基底側に向けるために、上皮細胞は、偏光BM分泌に特異的に捧げられた別の因子セットを必要とする。ショウジョウバエ卵巣のFEを用いて、ヌクレオチド交換因子(GEF)CragおよびStratum、GTPaseRab8およびRab10、ならびにホスホイノシチドPI(4,5)P2、ならびにキネシン1および3モータータンパク質20、28、29、30、31のレベルを含む、この新規な細胞プロセスのいくつかの成分が特徴付けられている20、28、29、30、31.これらの成分は、BMタンパク質の偏光分布を確実にする上で重要である。
FEにおけるBMタンパク質の細胞内局在をモニターするために、内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質(タンパク質トラップ)、例えばバイキング−GFP(Vkg−GFPまたはα2コールIV−GFP)およびペルレカン−GFP(Pcan−GFP)32、33を使用することができる。これらのタンパク質トラップラインは、BMタンパク質の内因性分布を正確に反映し、小胞トラフィッキングのより高感度な検出を可能にすることが示されている28,30。FEにおけるBMの偏光沈着に関与する成分は、Vkg−GFPおよびPcan−GFP20、28、29、30についてのタンパク質トラップラインを用いて最初に特徴付けられた。タンパク質トラップは、変異体およびGal4系統34を含む異なる遺伝的背景において使用することができる。さらに、タンパク質トラップを蛍光色素および/または蛍光免疫染色と組み合わせて使用することができ、野生型および変異型条件を比較する際にBMタンパク質の局在の正確な特性評価を可能にする35。
BMタンパク質含有小胞の分布および局在を正確かつ効率的に評価するために、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)および超解像イメージング技術は、他のイメージングアプローチに大きな利点を提示する。これらのアプローチは、高解像度イメージングと比較的使いやすさを兼ね備えています。CLSMは、ガルバノメータを使用してラスタースキャン方式で試料をレーザーでスキャンすることにより、光学分解能を向上させる顕微鏡技術です。ピンホール開口部は、共焦点顕微鏡のコアコンポーネントです。焦点面の上または下から来る焦点ずれ信号を遮断することによって、ピンホール開口部は、z軸36において非常に優れた分解能をもたらす。これはまた、一連の光学セクションに対応するzスタックと呼ばれるz平面内の一連の画像を得ることを可能にする。zスタックはその後、イメージングソフトウェアの助けを借りて、3D再構成を介して標本の3D画像を作成します。従来の落射蛍光(広視野)顕微鏡は、共焦点顕微鏡とは異なり、焦点の合わない光が画質に寄与し、画像の解像度とコントラストを低下させる36,37。これにより、落射蛍光顕微鏡は、タンパク質の局在化または共局在を研究する際の魅力の低い候補になります。
CLSMは、BMタンパク質の細胞内輸送のイメージングや特性評価など、さまざまなアプリケーションに適したアプローチですが、アッベの回折限界(200-250nm)未満のサンプルをイメージングする場合、依然として問題となります。このようなサンプルを画像化する場合、共焦点顕微鏡は、特にオイル対物レンズを使用する場合、高解像度をもたらし得る。しかし、超解像技術は共焦点顕微鏡の限界を超えています。超解像顕微鏡法を実現するにはさまざまなアプローチがあり、それぞれに特定の分解能限界があり、それぞれが異なる分析に適しています。これらのアプローチには、光活性化局在化顕微鏡(PALM)または確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、誘導放出枯渇顕微鏡(STED)、構造化照明顕微鏡(SIM)、およびエアリスキャン(超解像)顕微鏡38、39、40、41、42、43、44、45、46が含まれる。.Airyscanの解像度はPALM/STORM、STED、SIMよりも粗いですが、最大120nm(CLSMの約2倍の解像度)の解像度を達成できます。さらに、この超解像顕微鏡アプローチは、厚いサンプルおよび低い信号対雑音比のサンプルをイメージングする際に、SIMおよび他の超解像技術よりも有利であることが示されている47,48。
Airyscanは、比較的新しい超解像共焦点顕微鏡技術46である。ピンホール検出器とシングルポイント検出器を使用して焦点の合っていない光を除去する従来のCLSMとは異なり、この超解像アプローチは、すべてのスキャン位置45ですべての光を収集する32チャンネルガリウム砒素リン化物(GaAsP)光電子増倍管面積検出器を使用します。32個の検出器のそれぞれは小さなピンホールとして機能し、ピンホールのサイズを従来の1.0エアリーユニット(A.U.)から強化された0.2A.U.に縮小し、直径1.25A.U.の効率を維持しながら、さらに高い分解能と信号対雑音比を可能にします45。さらに、Airyscanで使用される線形デコンボリューションは、分解能45を最大2倍増加させます。これを考慮に入れると、CLSM、特に超解像顕微鏡は、局在化および共局在研究のための非常に高い解像度の画像を生成することができるため、BMタンパク質およびBMタンパク質の基礎沈着を調節するタンパク質の研究に適しており、それによってこれらのプロセスを制御する空間的、時間的、および分子的事象に新しい洞察を提供する。
局在化実験の実行に使用できる共焦点顕微鏡の代替アプローチは、画像デコンボリューションである。広視野顕微鏡は、焦点の合っていない光が検出器に到達することを可能にするので、広視野顕微鏡によって得られた画像から焦点の合っていない光を除去または再割り当てするために、数学的および計算的デコンボリューションアルゴリズムを適用することができ、それによって、画像49の解像度およびコントラストを改善することができる。デコンボリューションアルゴリズムは、共焦点画像にも適用して、解像度およびコントラストをさらに高め、超解像顕微鏡50のそれにほぼ匹敵する最終画像を生成することができる。Airyscanは、シェパードのピクセル再割り当てとともにワイナーフィルタベースのデコンボリューションを利用し、空間分解能と信号対雑音比を大幅に改善します。共焦点顕微鏡と比較して、この超解像顕微鏡技術を使用すると、3つの空間寸法(xおよびyで120nm、zで350nm)すべてで分解能が2倍の増加が観察される45,51。
この原稿は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEを共焦点および超解像顕微鏡と組み合わせたモデルシステムとして使用して、BMタンパク質の細胞内輸送および沈着を染色、取得、および視覚化するための詳細かつ最適化されたプロトコルを提供する。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質、例えばVkg−GFPおよびPcan−GFPを発現する ショウジョウバエ 系統は、BMタンパク質の輸送および分泌を視覚化するための効率的かつ正確なツールである。さらに、それらは、突然変異体および Gal4/UAS 系統34を含む異なる遺伝的背景において容易に使用することができる。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質が推奨されるが、特定のBMタンパク質に対する抗体の使用もまた、記載されたプロトコールと適合性がある。これらのプロトコルは、共焦点および超解像イメージングを使用して、細胞内輸送および無傷の上皮組織におけるBMタンパク質の分泌を研究することに関心のある科学者にとって特に有用である。さらに、上皮組織分析と ショウジョウバエ 遺伝学の広範なツールを組み合わせる能力は、このアプローチを特に強力にします。最後に、これらのプロトコルは、水疱輸送および関心のある他のタンパク質の選別を研究するために容易に適合させることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

基底膜(BM)は、上皮細胞の基底側に存在する細胞外マトリックスの特殊なシートであり、上皮組織の形態および器官形態形成の確立および維持に重要である。さらに、BMは組織モデリングに不可欠であり、シグナル伝達プラットフォームとして機能し、組織および器官を形成するための外力を提供する。正常な発達および病理学的状態においてBMが果たす多くの重要な役割にもかかわらず、BM含有小胞の細胞内輸送を制御する生物学的経路および基礎分泌がBMタンパク質の分極沈着にどのようにつながるかはほとんど理解されていない。 ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮は、BMのすべての主要成分を産生および分泌するため、BM膜タンパク質の基礎沈着を研究するための優れたモデルシステムです。この記事では、 ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮に内因的にタグ付けされたタンパク質を使用して、BM含有小胞および沈着BMを染色およびイメージングするための詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルは、定性的および定量的問題の両方に対処するために適用することができ、ハイスループットスクリーニングに対応するために開発され、上皮組織発達中の分極細胞内輸送および小胞の分泌に関与する因子の迅速かつ効率的な同定を可能にする。

本明細書に記載の方法は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEなどの分極上皮細胞におけるBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を効率的かつ正確に画像化し、特徴付けるために使用することができる。次に、上記の方法を使用して得られた予想される結果と、有用なアドバイスと潜在的な落とし穴を提供します。そうするために、内因的にタグ付けされたVkg(ショウジョウバエ ・コルIV...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

このプロトコルは、ショウジョウバエアレイをモデル系として用いて基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌の特性評価を可能にする。我々の技術の主な利点は、内因性にタグ付けされたタンパク質およびAiryscan超解像顕微鏡法を用いて、基底膜タンパク質の細胞内輸送の高解像度イメージングを可能にすることである。このプロトコルは基底膜タンパク質の細胞内輸送を画像化するために開発されているが、関心のある他のタンパク質および細胞培養およびオルガノイドを含む他の生物学的系の輸送を研究するために拡張することができる。まず、解剖スコープでPBS中のショウジョウバエ卵巣を解剖した後、1ミリリットルの固定溶液を加え、卵巣をナットプラットフォームに15分間固定する。固定溶液を取り出し、それぞれ1ミリリットルのPBSTで2回のクイック洗浄を行う。微量遠心チューブを5〜6回静かに反転させてから、ナットプラットフォームロッカー上で1ミリリットルのPBSTでそれぞれ10分間の長い洗浄を4回行います。固定と洗浄を行った後、PBSTを除去し、1ミリリットルのブロッキング溶液を加え、栄養プラットフォームロッカーで卵巣を最低1時間ブロックします。次に、ブロッキング溶液を取り出し、ブロッキング溶液中に適切な濃度で希釈された一次抗体を含む一次抗体溶液を300マイクロリットル加える。摂氏4度のナットプラットフォームロッカーで一晩インキュベートします。一次抗体溶液を除去した後、前述のように、2回のクイック洗浄と4回の長時間洗浄を行い、PBSTを除去し、使用した一次抗体を検出する蛍光二次抗体を含む500マイクロリットルの二次抗体溶液を加える。二次抗体溶液中の卵巣をナットリングプラットフォームロッカー上で室温で2時間インキュベートし、その後、ナットプラットフォームロッカーで以前に実証したように、PBSTで2回のクイックウォッシュと4回のロングウォッシュを実行します。最後の洗浄後、P-1000ピペットを使用して卵巣をチューブ内で上下に静かにピペットでピペットし、卵室を分離します。チューブを5〜10分間直立姿勢に保ち、卵室を底に沈ませます。次に、パスツールピペットを使用してPBSTを除去し、約50マイクロリットルを残します。その後、P-200ピペットを使用して残りのPBSTをできるだけ多く取り除き、カバースリップ上に均等に広がるのに十分な2滴のマウント媒体を追加します。粘性マウント媒体を微量遠心チューブからスライドに簡単に移送できるようにするには、P-200ピペットチップの端を切り取ります。次に、取り付け媒体内のすべての卵室をスライドガラスにゆっくりと移し、気泡を発生させないようにします。解剖顕微鏡下で、新しいP-200ピペットチップまたは鉗子を使用して、カバースリップのほぼサイズの領域をカバーするために、取り付け媒体と分離卵チャンバーを静かに広げます。鉗子を使用して、カバースリップを気泡を避けるために卵室に慎重に斜めに置き、スライドを室温で暗闇の平らな面に2日間保管して重合させます。マウントメディアが硬化したら、スライドを暗闇の中で4°Cで数週間保管してイメージングすることができます。基底膜タンパク質の細胞内局在を可視化するには、対物レンズを63倍に設定し、レンズに浸漬油を一滴静かに置き、カバースリップを対物レンズに向けるようにスライドを対物レンズの上に置き、検体の位置を特定します。エピ蛍光顕微鏡の接眼レンズを使用して関心領域を特定し、原稿に記載されているように蛍光色素分子を画像化するための適切な設定を含む構成を選択します。設定が完了したら、[集録モード]で[ライブ]を選択してサンプルをイメージし、ズームを2~4倍に調整してサンプルのスキャン領域を最適化します。個々のチャンネルごとに、[チャンネル]でトラックを選択し、[ライブ]をクリックします。レンジインジケータツールを使用しながらマスターゲインとレーザーパワーを調整し、すべてのガイドラインに従って、原稿に記載されているように飽和ピクセルを避け、各チャンネルで同じことを繰り返します。集録モードのトグルウィンドウの[画像サイズ]で、[SR]をクリックして検出器の機能を最大化し、フレームサイズを自動的に調整します。Airyscanモードでは平均化をNone にしておくと、通常は必要ではなく、スキャン時間が短縮されます。ただし、場合によっては、平均を2倍にすると信号対雑音比が向上し、スナップをクリックして画像を取得することがあります。Zスタックを取得するには、[取得]タブの下にある[Zスタック]チェックボックスをクリックします。次に、試料を観察するために所望のチャネルを選択する。たとえば、DAPIチャンネルで[ライブ]をクリックしてライブスキャンを開始し、顕微鏡の微調整ノブを使用してZスタックの範囲を設定します。その後、「最初に設定」および「最後に設定」をクリックして、Z スタックの端点を設定します。最適な3D再構成を行うには、Zスタックの間隔を0.5マイクロメートル未満に設定してステップサイズを割り当て、[実験の開始]をクリックしてZスタックの取得を開始します。画像またはZスタックを取得したら、[処理]、[方法]オプションをクリックし、[Airyscan処理]を選択します。オートフィルタを実行して開始し、必要に応じて、超解像値を変更してさらに手動処理を実行し、サンプルに最適な結果を得ます。最適なSR値が決定されたら、[適用]をクリックして処理された画像を生成します。Zスタック画像の場合、3D処理ボックスをクリックして、1つのZスライスとして、またはZスタック全体として処理します。Zスタックの取得後にタンパク質のトラフィッキングを3Dで視覚化するには、プレビューウィンドウの3Dアイコンをクリックして3D画像を生成し、Airyscan処理画像の表示制御セクションに表示されます。さまざまな 3D ビューオプションから、小胞の構造を表示するときは、サーフェスビューまたは混合ビューを使用します。最高品質の画像の場合、[最速] 設定の精度が低下し、3D レンダリングが悪くなるため、[正確] 設定を選択します。画像が生成されたら、ズームと回転によって3D画像を操作して、好みの位置に焦点を合わせます。ビューを取得したら、[3D]タブで[表示解像度]を選択し、[イメージの作成]をクリックすると、表示と同じ向きでイメージのスナップショットが作成され、さまざまなファイル形式で保存およびエクスポートできます。共焦点顕微鏡は、取得パラメータが最適化された場合に、Viking-GFPなどの基底膜タンパク質の細胞内局在および沈着を視覚化するために使用することができる。取得と画像処理を適切に行うと、超解像顕微鏡は共焦点顕微鏡と比較して画像解像度が向上します。バイキングなどの基底膜タンパク質の細胞内輸送におけるよりよく定義された画像によって示されるように。正射影は、共焦点または超解像イメージングを使用して、基底膜タンパク質を含む小胞および区画の全体的な分布を単一の画像で視覚化することを可能にする。共焦点または超解像イメージングによって撮影された光学Z切片のスタックを組み立てることによる3D再構成を用いて、細胞内基底膜タンパク質の局在および分布を評価した。超解像イメージングは、変異条件下での基底膜タンパク質の正確な局在を決定するために使用することができる。例えば、Cragノックダウン上皮細胞において、基底膜タンパク質は頂端および基底の両方に蓄積し、基底膜タンパク質の分極分泌を制御していることを示している。共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡は、共局在化実験にも用いることができる。例えば、この図は、バイキング-GFPとゴルジマーカーGM-130の部分的な共局在を示しており、バイキングが分泌前にゴルジ体に分類されていることを確認している。超解像顕微鏡を用いて基底膜タンパク質の輸送を効率的にイメージングするためには、卵巣を慎重に装着し、集録パラメータと畳み込みパラメータの設定時に特に注意を払うことをお勧めします。このプロトコルは、基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化するように最適化されている。しかし、目的の他のタンパク質のトラフィッキングを効率的に画像化するために容易に改変することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

発生生物学

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...