Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

저자는 줄리 머클 (Julie Merkle)이 원고에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R15GM137236에 의해 O.D.에 지원되었습니다. 공초점 및 초해상도 이미지는 NSF MRI 보조금 2018748로 구입 한 Airyscan 2와 함께 Zeiss LSM 900을 사용하여 획득했습니다.

1. 난소 해부를위한 비행 준비
<ol><li>원하는 유전자형의 초파리 멜라노가스터 암컷 파리(1-2일령)를 10-15~8 mL의 초파리 플라이 배지가 들어있는 좁은 바이알에 넣고 25°C에서 해부 2-3일 전에 소량의 과립화된 베이커스 효모를 뿌린다. 바이알에 수컷 몇 마리를 추가하면 계란 챔버 수율을 높일 수 있습니다. 그러나 난소 발달에 부정적인 영향을 줄 수 있으므로 파리의 총 ?...

BM은 배아 및 장기 형태 형성 및 성인 생리 기능에 중요합니다. 또한, BM은 상피 극성의 확립 및 유지를 위한 신호 전달 플랫폼 역할을 하며 조직에 지지체2를 제공한다. 그러나 BM 단백질의 적절한 배치를 조절하는 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. BM 단백질의 세포 내 밀매 및 양극화 된 분비에 전념하는 생물학적 경로를 더 잘 이해하려면 이러한 경로의 구성 요소와 BM 처리에?...

기저막(BM)은 상피 구조 및 형태형성에 중요한 층상 세포-부착성 세포외 매트릭스(ECM)의 얇은 시트이다1. 그것은 ∼50 개의 단백질을 포함하며 상피 및 내피 세포의 기초가되는 유비쿼터스하게 발견되며, 골격, 평활 및 심장 근육 세포 및 지방 세포 1,2,3을 감싸고 있습니다. 상피 세포의 기저부에서 BM의 세 가지 주요 구성 요소는 콜라겐 IV, 펄레칸 및 라미닌입니다. BM은 상피 세포의 기초가되며 조직 분리 및 장벽, 성장 및 지원, 세포 분극 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 포함한 많은 기능을 담당합니다. . 신호 전달 플랫폼으로서의 그의 역할은 발달 동안 상피 세포 및 조직의 형태학 및 분화를 조절한다 3,13,14. 더욱이, BM의 잘못된 조절 및/또는 그 완전성의 위반은 종양 전이 2,15,16을 포함한 많은 병리학적 상태의 주요 원인이다. 조직 및 기관 형태형성 동안 BM에 의해 수행되는 필수적인 기능에도 불구하고, 편광된 세포내 밀매 및 BM 단백질의 분비에 전념하는 생물학적 경로(들)의 성분들은 모호하게 알려져 있다.
BM 함유 소포의 세포 내 밀매와 상피 세포에 의한 BM 단백질의 분비를 연구하기 위해, 초파리 난소의 여포 상피 (FE)는 강력한 모델 시스템입니다 (그림 1). 초파리 난소는 난소라고 불리는 16-20 개의 긴 튜브 형 구조로 구성됩니다 (그림 1A, B) 17,18,19. 각 난소는 난자 조립 라인으로 생각할 수 있으며, 성숙한 난자가 난관을 통해 빠져 나올 때까지 앞쪽 끝에서 시작하여 후방으로 움직이는 계란 챔버 (각각 계란을 발생시킵니다)의 연령 진행과 함께 알 조립 라인으로 생각할 수 있습니다. 각 달걀 챔버는 중앙 생식 세포(GCs)를 둘러싸고 있는 체세포 모낭 세포(FCs)의 단층인 FE에 의해 캡슐화된다. FE는 정점 도메인이 생식계열을 향하는 뚜렷한 정점-기저 극성으로 고도로 편광되고, BM 단백질은 기저18,19로 분비된다. FC는 콜라겐 IV, 펄레칸 및 라미닌20,21을 포함한 BM의 모든 주요 성분을 적극적으로 분비합니다. FCs와 같은 상피 세포에서, BM 성분은 생산되고 그들의 세포외 침착을 위한 특수한 편광 분비 경로를 필요로 한다. 예를 들어, BM의 가장 풍부한 성분인 콜라겐 IV(Coll IV)의 경우, 그의 편광된 세포내 밀매와 분비를 둘러싼 세부사항은 그것의 생산 및 침착이 많은 연구의 초점임에도 불구하고 모호하다. Coll IV는 소포체(ER)로 번역되며, 이는 또한 여기서 각각의 피브릴-세 개의 폴리펩티드(2개의 α1 쇄 및 하나의 α2 쇄)로 구성된-삼중 나선(22)으로 조립된다. 적절한 Coll IV 폴딩 및 기능에는 Plod 및 PH4αEFB 20,22,23,24,25,26과 같은 리실 및 프롤릴-히드록실라제를 포함하는 ER 샤페론 및 효소가 필요합니다. 이러한 번역 후 효소는 Coll IV의 ER 분류를 조절하는데, 각각의 손실로 인해 Coll IV가 기 저 ER20,23,24,25,26에 갇히게 됩니다. 이어서, 새로 합성된 Coll IV는 COPII 코팅된 소포체에서 골지에 대한 ER을 빠져나간다. 화물 수용체 Tango1은 큰 다량체 단백질20,27을 수용 할 수있는 상당한 골지 결합 소포로 콜라겐을 포장하는 데 도움을줍니다. 일단 Coll IV가 세포내 외래 소포로 포장되면, 그것은 상피 세포로부터 기저로 특이적으로 분비된다. BM 침착을 기저측으로 지시하기 위해, 상피 세포는 편광된 BM 분비에 특별히 전념하는 또 다른 인자 세트를 필요로 한다. 초파리 난소의 FE를 사용하여, 뉴클레오티드 교환 인자 (GEFs) Crag 및 Stratum, GTPases Rab8 및 Rab10뿐만 아니라 포스포이노시타이드 PI (4,5) P2, 및 Kinesin 1 및 3 모터 단백질 20,28,29,30,31의 수준을 포함하여이 새로운 세포 과정의 몇 가지 구성 요소가 특성화되었습니다. . 이러한 성분은 BM 단백질의 편광 분포를 보장하는 데 중요합니다.
FE 내의 BM 단백질의 세포내 국소화를 모니터링하기 위해, 내인성 태깅된 기저막 단백질(단백질 트랩), 예컨대 바이킹-GFP(Vkg-GFP 또는 α2 Coll IV-GFP) 및 펄레칸-GFP(Pcan-GFP)32,33이 사용될 수 있다. 이러한 단백질 트랩 라인은 BM 단백질의 내인성 분포를 정확하게 반영하고 수포 밀매28,30의 더 민감한 검출을 허용하는 것으로 나타났다. FE에서 BM의 편광 증착에 관여하는 성분들은 먼저 Vkg-GFP 및 Pcan-GFP 20,28,29,30에 대한 단백질 트랩 라인을 사용하여 특성화되었다. 단백질 트랩은 돌연변이체 및 Gal4 라인(34)을 포함하는 상이한 유전적 배경에서 사용될 수 있다. 더욱이, 단백질 트랩은 형광 염료 및/또는 형광 면역염색과 함께 사용될 수 있어, 야생형 및 돌연변이 조건(35)을 비교할 때 BM 단백질의 국소화의 정밀한 특성화를 가능하게 한다.
BM 단백질 함유 소포의 분포 및 국재화를 정확하고 효율적으로 평가하기 위해, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 및 초분해능 이미징 기술은 다른 이미징 접근법에 상당한 이점을 제시한다. 이러한 접근 방식은 고해상도 이미징과 상대적으로 사용하기 쉬운 방법을 결합합니다. CLSM은 갈바노미터를 사용하여 래스터 스캔 방식으로 레이저로 시편을 스캔하여 광학 분해능을 향상시킬 수 있는 현미경 기술입니다. 핀홀 조리개는 공초점 현미경의 핵심 구성 요소입니다. 초점면의 위 또는 아래에서 오는 초점이 맞지 않는 신호를 차단함으로써, 핀홀 조리개는 z축(36)에서 매우 우수한 분해능을 가져온다. 이것은 또한 일련의 광학 섹션에 해당하는 z-스택이라고 불리는 z-평면에서 일련의 이미지를 얻을 수있게합니다. z-스택은 이후 이미징 소프트웨어의 도움으로 3D 재구성을 통해 시편의 3D 이미지를 생성합니다. 기존의 에피형광(와이드필드) 현미경은 공초점 현미경과 달리 초점이 맞지 않는 빛이 이미지 품질에 기여하여 이미지 해상도와 콘트라스트(36,37)를 감소시킵니다. 이것은 epifluorescence 현미경을 단백질 국소화 또는 공동 국소화를 연구 할 때 덜 매력적인 후보로 만듭니다.
CLSM은 BM 단백질의 세포 내 밀매의 이미징 및 특성화를 포함한 다양한 응용에 적합한 접근법이지만, 아베의 빛의 회절 한계 (200-250 nm) 이하의 샘플을 이미징 할 때 여전히 문제가 있습니다. 이러한 샘플을 이미징 할 때, 공초점 현미경 검사, 특히 오일 목표를 사용할 때 높은 해상도를 초래할 수 있습니다. 그러나 초분해능 기술은 공초점 현미경의 한계를 뛰어 넘습니다. 초분해능 현미경을 달성하기 위한 다양한 접근법이 있으며, 각 현미경에는 특정 분해능 한계가 있으며 각 현미경은 서로 다른 분석에 적합합니다. 이러한 접근법에는 광활성화 국소화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM), 자극 방출 고갈 현미경 (STED), 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 및 Airyscan (초해상도) 현미경 38,39,40,41,42,43,44,45,46이 포함됩니다. . Airyscan은 PALM / STORM, STED 및 SIM보다 거친 해상도를 가지고 있지만 최대 ~ 120nm (CLSM의 약 두 배)의 해상도를 달성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 초분해능 현미경 접근 방식은 낮은 신호 대 잡음비47,48로 두꺼운 샘플 및 샘플을 이미징할 때 SIM 및 기타 초분해능 기술에 비해 이점이 있는 것으로 나타났습니다.
Airyscan은 비교적 새로운 초분해능 공초점 현미경 기술(46)이다. 핀홀 및 단일 포인트 검출기를 사용하여 초점이 맞지 않는 광을 거부하는 기존의 CLSM과는 달리, 이 초분해능 접근법은 모든 스캔 위치(45)에서 모든 광을 수집하는 32채널 갈륨 비소 포스피드(GaAsP) 광승수 튜브 영역 검출기를 사용합니다. 32개의 검출기 각각은 작은 핀홀로 작동하여 핀홀 크기를 기존 1.0 Airy Unit(A.U.)에서 향상된 0.2A.U.로 줄여 1.25A.U. 직경45의 효율을 유지하면서 더 높은 분해능과 신호 대 잡음비를 실현합니다. 또한, Airyscan이 사용하는 선형 디컨볼루션은 해상도(45)에서 최대 2배 증가를 초래한다. 이를 고려하여 CLSM, 특히 초분해능 현미경은 BM 단백질의 기초 침착을 조절하는 BM 단백질 및 단백질을 연구하는 데 매우 적합하며, 이는 국소화 및 공국재화 연구를 위한 매우 고해상도 이미지를 생성할 수 있기 때문에 이러한 과정을 제어하는 공간적, 시간적, 분자적 사건에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
국소화 실험을 수행하는 데 사용할 수 있는 공초점 현미경에 대한 대안적인 접근법은 이미지 디컨볼루션입니다. 광시야 현미경 검사는 초점이 맞지 않는 빛이 검출기에 도달할 수 있게 하기 때문에, 수학적 및 전산 디컨볼루션 알고리즘을 적용하여 광역 현미경에 의해 획득된 이미지로부터 초점이 맞지 않는 광을 제거하거나 재할당할 수 있고, 이로써 이미지(49)의 해상도 및 대비를 향상시킬 수 있다. Deconvolution 알고리즘은 또한 공초점 이미지에 적용되어 해상도와 콘트라스트를 더욱 증가시킬 수 있으며, 초해상도 현미경(50)의 최종 이미지와 거의 유사한 최종 이미지를 생성할 수 있다. Airyscan은 Weiner 필터 기반 디컨볼루션과 셰퍼드의 픽셀 재할당을 사용하여 공간 분해능과 신호 대 잡음비를 크게 향상시킵니다. 공초점 현미경과 비교하여, 이 초분해능 현미경 기술45,51을 사용할 때 세 가지 공간 차원(x 및 y에서 120nm, z에서 350nm) 모두에서 분해능이 2배 증가한 것이 관찰됩니다.
이 원고는 공초점 및 초분해능 현미경과 결합 된 모델 시스템으로 초파리 난소의 FE를 사용하여 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 침착을 염색, 획득 및 시각화하기위한 상세하고 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 내인성으로 태그된 기저막 단백질, 예를 들어, Vkg-GFP 및 Pcan-GFP를 발현하는 초파리 라인은 BM 단백질 밀매 및 분비를 가시화하는 효율적이고 정확한 도구이다. 또한, 이들은 돌연변이 및 Gal4/UAS 라인(34)을 포함하는 상이한 유전적 배경에서 용이하게 사용될 수 있다. 내인성으로 태그된 기저막 단백질이 권장되지만, 특정 BM 단백질에 대한 항체의 사용은 또한 기술된 프로토콜과 양립가능하다. 이러한 프로토콜은 공초점 및 초해상도 이미징을 사용하여 손상되지 않은 상피 조직에서 세포 내 밀매 및 BM 단백질 분비를 연구하는 데 관심이있는 과학자들에게 특히 유용합니다. 또한, 상피 조직 분석을 초파리 유전학의 광범위한 도구와 결합 할 수있는 능력은이 접근법을 특히 강력하게 만듭니다. 마지막으로, 이러한 프로토콜은 수포 밀매 및 관심있는 다른 단백질의 분류를 연구하기 위해 쉽게 적응 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

기저막 (BM) - 상피 세포의 기저 측에 존재하는 세포 외 매트릭스의 특수 시트 - 상피 조직 형태학 및 장기 형태 형성의 확립 및 유지에 중요합니다. 또한, BM은 조직 모델링에 필수적이며, 신호 전달 플랫폼 역할을하며, 조직과 장기를 형성하기위한 외부 힘을 제공합니다. BM이 정상적인 발달 및 병리학적 조건 동안 수행하는 많은 중요한 역할에도 불구하고, BM 함유 소포의 세포내 밀매를 조절하는 생물학적 경로와 기저 분비가 BM 단백질의 양극화 된 침착으로 이어지는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 초파리 난소의 여포 상피는 BM의 모든 주요 성분을 생산하고 분비하기 때문에 BM 막 단백질의 기초 침착을 연구하는 훌륭한 모델 시스템입니다. 공초점 및 초해상도 이미징은 고정 된 조직에서의 이미지 처리와 결합하여 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 침착에 특히 관여하는 세포 요인의 식별 및 특성화를 가능하게합니다. 이 기사는 초파리 난소의 여포 상피에서 내인성 태그가 지정된 단백질을 사용하여 BM 함유 소포 및 침착된 BM을 염색 및 이미징하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 질적 및 양적 질문을 모두 해결하기 위해 적용될 수 있으며 고처리량 스크리닝을 수용하기 위해 개발되어 상피 조직 개발 중에 편광 된 세포 내 밀매 및 소포 분비와 관련된 요인을 신속하고 효율적으로 식별 할 수 있습니다.

본원에 기재된 방법은 초파리 난소의 FE와 같은 편광된 상피 세포에서 BM 단백질의 세포내 밀매 및 분비를 효율적이고 정확하게 이미지화하고 특성화하는데 사용될 수 있다. 다음으로, 우리는 설명 된 방법을 사용하여 얻은 예상 결과뿐만 아니라 유용한 조언 및 잠재적 인 함정을 제공합니다. 그렇게 하기 위해, Vkg-GFP, 내인성 태깅된 Vkg(초파리 콜 IV)이 사용된다. 그러나, 동일한 결과?...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

기저막은 발달 동안 조직 및 장기 형태 형성에 필수적입니다. 이 구조의 적절한 배치로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 제시된 프로토콜은 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 상피 세포에서 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하고 특성화하는 방법을 설명합니다.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

이 프로토콜은 초파리 어레이를 모델 시스템으로 사용하여 세포내 트래피킹 및 기저막 단백질의 분비의 특성화를 허용한다. 우리 기술의 가장 큰 장점은 내인성 태깅 단백질과 Airyscan 초해상도 현미경을 사용하여 기저막 단백질의 세포 내 밀매에 대한 고해상도 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 프로토콜은 기저막 단백질의 세포 내 트래피킹을 이미지화하기 위해 개발되었지만, 관심있는 다른 단백질 및 세포 배양 및 오가노이드를 포함한 다른 생물학적 시스템의 밀매를 연구하기 위해 확장 될 수 있습니다.시작하려면 해부 범위에서 PBS의 초파리 난소를 해부 한 후 1 밀리리터의 고정 용액을 추가하고 난소를 15 분 동안 영양가있는 플랫폼에 고정시킵니다. 고정 용액을 제거하고 각각 한 밀리리터의 PBST로 두 번의 빠른 세척을 수행하십시오. 마이크로원심분리 튜브를 다섯 번 내지 여섯 번 부드럽게 반전시켜, 영양가 플랫폼 로커 상에서 PBST의 밀리리터로 각각 10분의 네 번의 긴 세척을 수행한다.고정 및 세척을 수행 한 후 PBST를 제거한 다음 한 밀리리터의 블로킹 용액을 추가하고 최소 한 시간 동안 영양가있는 플랫폼 로커에서 난소를 차단하십시오. 다음으로, 블로킹 용액을 제거하고 블로킹 용액에 적절한 농도로 희석된 일차 항체를 포함하는 일차 항체 용액 300 마이크로리터를 첨가한다. 섭씨 4도의 영양가있는 플랫폼 로커에서 밤새 배양하십시오.일차 항체 용액을 제거한 후, 이전에 입증된 바와 같이 두 번의 빠른 세척과 네 번의 긴 세척을 수행한 다음, PBST를 제거하고 사용된 일차 항체를 검출할 형광 이차 항체를 포함하는 이차 항체 용액 500 마이크로리터를 첨가한다. 이차 항체 용액의 난소를 실온에서 두 시간 동안 영양화 플랫폼 로커 상에서 인큐베이션한 다음, 영양가 플랫폼 로커 상에서 이전에 입증된 바와 같이 PBST에서 두 번의 빠른 세척과 네 번의 긴 세척을 수행한다. 마지막 세척 후 P-1000 피펫을 사용하여 난소를 튜브에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 계란 챔버를 분리하십시오.튜브를 5 ~ 10 분 동안 똑바로 세운 상태로 유지하여 달걀 챔버가 바닥으로 가라 앉도록하십시오. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBST를 제거하고 약 50 마이크로리터를 남긴다. 그런 다음 P-200 피펫을 사용하여 나머지 PBST를 최대한 제거하고 커버 슬립에 고르게 퍼질 정도로 장착 매체 두 방울을 추가하십시오.점성 장착 매체를 마이크로 원심분리 튜브에서 슬라이드로 쉽게 옮길 수 있도록 P-200 피펫 팁의 끝을 차단하십시오. 다음으로, 장착 매체의 모든 달걀 챔버를 천천히 유리 슬라이드로 옮겨 거품이 생기지 않도록하십시오. 해부 현미경으로 새로운 P-200 피펫 팁 또는 포셉을 사용하여 장착 매체를 부드럽게 펼치고 분리 된 달걀 챔버를 커버 슬립 크기의 영역을 덮습니다.포셉을 사용하여 조심스럽게 덮개 슬립을 달걀 챔버에 비스듬히 올려 거품을 피하고 슬라이드를 어둠 속의 평평한 표면에 실온에서 이틀 동안 보관하여 중합하십시오. 장착 매체가 경화되면 슬라이드를 이미징을 위해 몇 주 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다. 기저막 단백질의 세포 내 국소화를 시각화하려면 목표를 63x로 설정하고 렌즈에 침지 오일 한 방울을 부드럽게 놓은 다음 표지 슬립이 대상을 향하도록 슬라이드를 대물점에 위치시켜 표본을 찾습니다.에피형광 현미경의 아이피스를 사용하여 관심 영역을 찾은 다음, 원고에 설명된 대로 형광단을 이미지에 대한 적절한 설정으로 구성하여 선택합니다. 구성이 설정되면 수집 모드에서 라이브를 선택하여 샘플을 이미지화하고 2와 4x 사이의 확대/축소를 조정하여 샘플의 스캔 영역을 최적화합니다. 각 개별 채널에 대해 채널에서 트랙을 선택하고 라이브를 클릭합니다.범위 표시기 도구를 사용하는 동안 마스터 게인과 레이저 파워를 조정하고 모든 지침에 따라 원고에 설명된 포화 픽셀을 피하면서 각 채널에 대해 동일한 것을 반복하십시오. 획득 모드 토글 창의 이미지 크기에서 SR을 클릭하여 감지기의 기능을 최대화하고 프레임 크기를 자동으로 조정합니다. Airyscan 모드에서는 일반적으로 필요하지 않으며 스캔 시간이 줄어들 것이므로 평균을 None으로 유지하십시오.그러나 경우에 따라 평균 2x를 사용하면 신호 대 잡음비가 향상될 수 있으며, 스냅을 클릭하여 이미지를 획득할 수 있습니다. Z-스택을 획득하려면 획득 탭 아래의 Z-스택 체크상자를 클릭하십시오. 다음으로, 시편을 관찰할 원하는 채널을 선택하십시오.예를 들어, DAPI 채널은 라이브를 클릭하고 라이브를 클릭하여 라이브 스캔을 시작한 다음 현미경의 미세 조정 노브를 사용하여 Z 스택의 범위를 설정합니다. 그런 다음 먼저 설정 및 마지막 설정을 클릭하여 Z 스택의 끝점을 설정합니다. 최적의 3D 재구성을 위해 Z 스택의 간격을 0.5마이크로미터보다 낮게 설정하여 단계 크기를 할당하고 실험 시작을 클릭하여 Z-스택 수집을 시작합니다.이미지 또는 Z 스택을 얻은 후 처리, 방법 옵션을 클릭하고 Airyscan 처리를 선택하십시오. 자동 필터를 수행하여 시작하고 필요한 경우 초해상도 값을 변경하여 추가 수동 처리를 수행하여 샘플에 가장 적합한 결과를 얻습니다. 최적의 SR 값이 결정되면 적용을 클릭하여 처리된 이미지를 생성합니다.Z 스택 이미지의 경우 3D 처리 상자를 클릭하여 하나의 Z 슬라이스 또는 전체 Z 스택으로 처리합니다. Z-스택 획득 후 3D로 단백질 밀매를 시각화하려면 Airyscan 처리 이미지의 디스플레이 제어 섹션에 나타나는 미리보기 창에서 3D 아이콘을 클릭하여 3D 이미지를 생성합니다. 다양한 3D 보기 옵션에서 소포의 구조를 볼 때 서피스 또는 혼합 뷰를 사용합니다.최고 품질의 이미지를 얻으려면 가장 빠른 설정이 정확도가 떨어지고 3D 렌더링이 불량해지므로 정밀 설정을 선택합니다. 이미지가 생성되면 원하는 위치에 초점을 맞추기 위해 확대/축소 및 회전하여 3D 이미지를 조작합니다. 뷰를 얻은 후 3D 탭에서 표시된 해상도를 선택한 다음 이미지 만들기를 클릭하면 이미지를 본 것과 동일한 방향으로 이미지의 스냅 샷이 생성되고 다양한 파일 형식으로 저장 및 내보낼 수 있습니다.공초점 현미경은 획득 파라미터가 최적화될 때 바이킹-GFP와 같은 기저막 단백질의 세포내 국소화 및 침착을 시각화하는데 사용될 수 있다. 획득 및 이미지 처리가 제대로 수행되면 초해상도 현미경은 공초점 현미경에 비해 이미지 해상도를 증가시킵니다. 바이킹과 같은 기저막 단백질의 세포내 밀매에서 더 잘 정의된 이미지에 의해 예시된 바와 같이.직교 투영은 공초점 또는 초해상도 이미징을 사용하여 단일 이미지에서 기저막 단백질을 포함하는 소포 및 구획의 전체 분포를 시각화 할 수있게합니다. 공초점 또는 초분해능 이미징에 의해 취해진 광학 Z-절편의 스택을 조립하여 3D 재구성을 사용하여 세포 내 기저막 단백질의 국소화 및 분포를 평가했습니다. 초분해능 이미징은 돌연변이 조건에서 기저막 단백질의 정확한 국소화를 결정하는데 사용될 수 있다.예를 들어, Crag 녹다운 상피 세포에서, 기저막 단백질은 정점과 기저로 모두 축적되어, 기저막 단백질의 편광된 분비를 조절한다는 것을 나타낸다. 공초점 및 초분해능 현미경 검사는 또한 공동 국소화 실험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 그림은 바이킹-GFP와 골지 마커인 GM-130의 부분적인 공동-국소화를 보여주며, 바이킹이 분비되기 전에 골지로 분류됨을 확인한다.초분해능 현미경을 사용하여 기저막 단백질의 밀매를 효율적으로 이미지화하려면 난소를 조심스럽게 장착하고 획득 및 컨볼루션 매개 변수를 설정할 때 특히주의를 기울이는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하도록 최적화되어 있습니다. 그러나, 관심있는 다른 단백질의 밀매를 효율적으로 이미지화하기 위해 쉽게 변형될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

연구

발생학

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...