Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Forfatterne er takknemlige til Julie Merkle for hennes nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R15GM137236 til O.D. De konfokale og superoppløselige bildene ble anskaffet ved hjelp av en Zeiss LSM 900 med Airyscan 2, kjøpt med NSF MR-tilskudd 2018748.

1. Flyforberedelse for eggstokk disseksjoner
<ol><li>Sett 10-15 Drosophila melanogaster kvinnelige fluer (1-2 dager gammel) av ønsket genotype i et smalt hetteglass som inneholder ~ 8 ml Drosophila fly medium sprinklet med en liten mengde granulert bakergjær 2-3 dager før disseksjon ved 25 °C. Å legge til noen menn til hetteglasset kan øke eggkammerutbyttet. Sørg imidlertid for at det totale antall fluer ikke overstiger 20, da dette kan påvirke eggstokkutviklingen negativt.<b...

BM er kritisk for embryonal og organmorfogenese, og voksne fysiologiske funksjoner. Videre fungerer BM som en signalplattform for etablering og vedlikehold av epitel polaritet og gir vev med støtte2. Likevel er mekanismene som regulerer riktig plassering av BM-proteiner dårlig forstått. En bedre forståelse av de biologiske veiene dedikert til intracellulær smugling og polarisert sekresjon av BM-proteiner krever en nøye analyse av komponentene i disse veiene og deres roller i BM-prosessering....

Kjellermembranen (BM) er et tynt ark med lagdelt celletilknyttet ekstracellulær matrise (ECM) som er kritisk for epitelstruktur og morfogenese1. Den består av ~ 50 proteiner og finnes allestedsnærværende underliggende epitel- og endotelceller, og omkranser skjelett-, glatt- og hjertemuskelceller og adipocytter 1,2,3. De tre hovedkomponentene i BM på basalsiden av epitelcellene er Kollagen IV, Perlecan og Laminins. BM ligger til grunn for epitelcellene og er ansvarlig for mange funksjoner, inkludert vevsseparasjon og barriere, vekst og støtte, og cellepolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dens rolle som signalplattform regulerer morfologi og differensiering av epitelceller og vev under utvikling 3,13,14. Videre er feilregulering av BM og / eller et brudd i integriteten hovedårsakene til mange patologiske forhold, inkludert tumormetastase 2,15,16. Til tross for de essensielle funksjonene som utføres av BM under vev og organmorfogenese, er komponentene i de biologiske banene dedikert til polarisert intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner vagt kjent.
For å studere intracellulær smugling av BM-inneholdende vesikler og sekresjon av BM-proteiner ved epitelceller, er follikulær epitel (FE) av Drosophila eggstokken et kraftig modellsystem (figur 1). En Drosophila eggstokk består av 16-20 lange, rørlignende strukturer, kalt ovarioles (Figur 1A, B) 17,18,19. Hver ovariol kan betraktes som en eggmonteringslinje, med aldersprogresjonen av eggkamre (som hver gir opphav til et egg) som begynner i den fremre enden og beveger seg bakre, til det modne egget kommer ut gjennom ovidukten. Hvert eggkammer er innkapslet av FE, en monolayer av somatiske follikkelceller (FCs), som omgir de sentrale bakteriecellene (GCs). FE er svært polarisert med en distinkt apikal-basal polaritet der det apikale domenet vender mot bakterien, og BM-proteinene utskilles basalt 18,19. FCene skiller aktivt ut alle hovedkomponentene i BM, inkludert Collagen IV, Perlecan og Laminins20,21. I epitelceller som FCs produseres BM-komponentene og krever en spesialisert polarisert sekresjonsvei for deres avsetning ekstracellulært. For eksempel, når det gjelder den mest tallrike komponenten i BM, Collagen IV (Coll IV), er detaljene rundt polarisert intracellulær smugling og sekresjon vage til tross for at produksjonen og avsetningen er fokus for mange studier. Coll IV er oversatt i endoplasmic retikulum (ER), som også er der hver fibril - sammensatt av tre polypeptider (to α1 kjeder og en α2 kjede) - er samlet i en trippel helix22. Riktig Coll IV folding og funksjon krever ER anstander og enzymer, inkludert lysyl og prolyl-hydroksylaser som Plod og PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Disse posttranslasjonelle enzymene regulerer ER-sorteringen av Coll IV, da tapet av hver fører til at Coll IV blir fanget i basal ER 20,23,24,25,26. Deretter avslutter nysyntetisert Coll IV ER for Golgi i COPII-belagte vesikler. Lastreseptoren Tango1 hjelper til med å pakke kollagener i betydelige Golgi-bundet vesicles som kan romme store multimeriske proteiner20,27. Når Coll IV er pakket inn i intracellulære eksokytiske vesicles, utskilles det spesielt basalt fra epitelceller. For å lede BM-avsetning til basalsiden krever epitelceller et annet sett med faktorer spesielt dedikert til polarisert BM-sekresjon. Ved hjelp av FE av Drosophila eggstokken, noen få komponenter i denne nye cellulære prosessen har blitt karakterisert, inkludert nukleotidutvekslingsfaktorene (GEFs) Crag og Stratum, GTPases Rab8 og Rab10, samt nivåene av fosfoinositide PI(4,5)P2 og Kinesin 1 og 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Disse komponentene er avgjørende for å sikre polarisert fordeling av BM-proteiner.
For å overvåke intracellulær lokalisering av BM-proteiner i FE, kan endogene merkede kjellermembranproteiner (proteinfeller), som Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) og Perlecan-GFP (Pcan-GFP) brukes32,33. Disse proteinfellelinjene har vist seg å nøyaktig gjenspeile den endogene fordelingen av BM-proteiner og muliggjøre mer sensitiv deteksjon av bilikulærmenneskehandel 28,30. Komponentene som var involvert i polarisert avsetning av BM i FE ble først karakterisert ved hjelp av proteinfellelinjer for Vkg-GFP og Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfeller kan brukes i forskjellige genetiske bakgrunner, inkludert mutanter og Gal4-linjer 34. Videre kan proteinfeller brukes i kombinasjon med fluorescerende fargestoffer og / eller fluorescensimmunisering, noe som muliggjør presis karakterisering av lokalisering av BM-proteiner når man sammenligner villtype og mutantforhold35.
For å nøyaktig og effektivt vurdere distribusjon og lokalisering av BM proteinholdige vesikler, konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) og super-oppløsning bildebehandling teknikker utgjør en betydelig fordel for andre bildebehandling tilnærminger. Disse tilnærmingene kombinerer bildebehandling med høy oppløsning med relativt brukervennlighet. CLSM er en mikroskopiteknikk som muliggjør en forbedret optisk oppløsning ved å skanne prøven med en laser på en rasterskanning ved hjelp av galvanisometere. Pinhole blenderåpningen er en kjernekomponent i et konfokalt mikroskop. Ved å blokkere signalene som kommer ovenfra eller under brennplanet, resulterer pinhole-blenderåpningen i en svært overlegen oppløsning i z-aksen36. Dette gjør det også mulig å få en serie bilder i z-planet, kalt en z-stack, som tilsvarer en rekke optiske seksjoner. z-stabler lager deretter et 3D-bilde av prøven, via 3D-rekonstruksjon, ved hjelp av bildeprogramvare. Konvensjonelle epifluorescence (widefield) mikroskoper, i motsetning til konfektmikroskoper, gjør det mulig for lyset utenfor fokus å bidra til bildekvalitet, redusert bildeoppløsning og kontrast36,37. Dette gjør epifluorescensmikroskopi til en mindre attraktiv kandidat når man studerer proteinlokalisering eller colokalisering.
Selv om CLSM er en passende tilnærming for ulike bruksområder, inkludert avbildning og karakterisering av intracellulær smugling av BM-proteiner, presenterer den fortsatt et problem når man ser for seg prøver under Abbes diffraksjonsgrense for lys (200-250 nm). Ved avbildning av slike prøver kan konfektmikroskopi, spesielt når du bruker et oljemål, føre til høy oppløsning. Imidlertid overgår superoppløsningsteknikker grensen for konfektmikroskopi. Det finnes ulike tilnærminger for å oppnå mikroskopi med superoppløsning, hver med spesifikke oppløsningsgrenser, og hver egnet for ulike analyser. Disse tilnærmingene inkluderer fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), stimulert utslippsnedbrytningsmikroskopi (STED), strukturert belysningsmikroskopi (SIM) og Airyscan (superoppløsning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Selv om Airyscan har en grovere oppløsning enn PALM/STORM, STED og SIM, kan den fortsatt oppnå en oppløsning på opptil ~ 120 nm (omtrent dobbelt så høy oppløsning som CLSM). Videre har denne mikroskopitilnærmingen med superoppløsning vist seg å ha en fordel i forhold til SIM og andre superoppløsningsteknikker når du ser på tykke prøver og prøver med et lavt signal-til-støy-forhold47,48.
Airyscan er en relativt ny superoppløselig konfokal mikroskopiteknologi46. I motsetning til tradisjonelle CLSMer, som bruker pinhole og enkeltpunktdetektorer for å avvise lyset utenfor fokus, bruker denne superoppløsningsmetoden en 32-kanals gallium arsenidfosfid (GaAsP) fotomultiplier rørområdedetektor som samler alt lyset i hver skanneposisjon45. Hver av de 32 detektorene fungerer som et lite hull, noe som reduserer pinhole-størrelsen fra den tradisjonelle 1,0 Airy Unit (A.U.) til et forbedret 0,2 A.U., noe som muliggjør en enda høyere oppløsning og signal-til-støy-forhold, samtidig som effektiviteten til en diameter på 1,25 a.U.45 opprettholdes. Videre resulterer den lineære dekonvolusjonen som brukes av Airyscan i opptil en 2x økning i oppløsning45. Med tanke på dette er CLSM, og spesielt superoppløselig mikroskopi, godt egnet til å studere BM-proteiner og proteiner som regulerer basal avsetning av BM-proteiner, da de kan produsere svært høyoppløselige bilder for lokaliserings- og colokaliseringsstudier, og dermed gi ny innsikt i de romlige, tidsmessige og molekylære hendelsene som styrer disse prosessene.
En alternativ tilnærming til konfektmikroskopi som kan brukes til å utføre lokaliseringseksperimenter er bildedekonvolusjon. Siden widefield-mikroskopi gjør det mulig for lyset utenfor fokus å nå detektorene, kan matematiske og beregningsmessige dekonvolusjonsalgoritmer brukes til å fjerne eller tilordne lyset utenfor fokus fra bilder oppnådd ved widefield-mikroskopi, og dermed forbedre oppløsningen og kontrasten til bildet49. Dekonvolusjonsalgoritmer kan også brukes på konfiskeringsbilder for å øke oppløsningen og kontrasten ytterligere, og produsere endelige bilder som nesten kan sammenlignes med superoppløsningsmikroskopi50. Airyscan benytter seg av Weiner filterbasert dekonvolusjon sammen med Sheppards pikselomplassering, noe som resulterer i en svært forbedret romlig oppløsning og signal-til-støy-forhold. Sammenlignet med konfektmikroskopi observeres en økning på 2x i oppløsning i alle tre romlige dimensjoner (120 nm i x og y, og 350 nm i z) ved bruk av denne mikroskopiteknikken med superoppløsning45,51.
Dette manuskriptet gir detaljerte og optimaliserte protokoller for å flekke, anskaffe og visualisere intracellulær smugling og avsetning av BM-proteiner ved hjelp av FE av Drosophila-eggstokken som et modellsystem kombinert med konfokal og superoppløselig mikroskopi. Drosophila linjer som uttrykker endogene tagget kjeller membran proteiner, for eksempel Vkg-GFP og Pcan-GFP, er effektive og nøyaktige verktøy for å visualisere BM protein trafficking og sekresjon. I tillegg kan de enkelt brukes i forskjellige genetiske bakgrunner, inkludert mutant og Gal4 / UAS linjer34. Selv om endogent merkede kjellermembranproteiner anbefales, er bruk av antistoffer mot spesifikke BM-proteiner også kompatibel med de beskrevne protokollene. Disse protokollene er spesielt nyttige for forskere som er interessert i å studere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i intakt epitelvev ved hjelp av konfomisk og superoppløselig avbildning. Videre gjør evnen til å kombinere epitelvevsanalyse med de ekspansive verktøyene til Drosophila genetikk denne tilnærmingen spesielt kraftig. Til slutt kan disse protokollene enkelt tilpasses for å studere bilhandel og sortering av andre proteiner av interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

Kjellermembranen (BM) - et spesialisert ark med ekstracellulær matrise tilstede på basalsiden av epitelceller - er avgjørende for etablering og vedlikehold av epitelvevmorfologi og organmorfogenese. Videre er BM avgjørende for vevsmodellering, som fungerer som en signalplattform, og gir eksterne krefter til å forme vev og organer. Til tross for de mange viktige rollene som BM spiller under normal utvikling og patologiske forhold, er de biologiske veiene som kontrollerer den intracellulære smuglingen av BM-inneholdende vesikler og hvordan basal sekresjon fører til polarisert avsetning av BM-proteiner dårlig forstått. Follikulær epitel av Drosophila eggstokken er et utmerket modellsystem for å studere basal avsetning av BM membran proteiner, som det produserer og utskiller alle viktige komponenter i BM. Confocal og super-oppløsning avbildning kombinert med bildebehandling i faste vev gjør det mulig å identifisere og karakterisere cellulære faktorer spesielt involvert i intracellulær trafficking og avsetning av BM proteiner. Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for farging og avbildning av BM-inneholdende vesicles og avsatt BM ved hjelp av endogenet merkede proteiner i follikulær epitel av Drosophila eggstokken. Denne protokollen kan brukes til å håndtere både kvalitative og kvantitative spørsmål, og den ble utviklet for å imøtekomme screening med høy gjennomstrømning, noe som muliggjør rask og effektiv identifisering av faktorer som er involvert i polarisert intracellulær smugling og sekresjon av vesikler under epitelvevsutvikling.

Metodene beskrevet heri kan brukes til å effektivt og nøyaktig bilde og karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i polariserte epitelceller, for eksempel FE av Drosophila eggstokken. Deretter gir vi forventede resultater oppnådd ved hjelp av de beskrevne metodene, samt nyttige råd og potensielle fallgruver. For å gjøre dette brukes Vkg-GFP, en endogenet merket Vkg (Drosophila Col IV). Imidlertid kan de samme resultatene oppnås med andre endogene taggede BM-proteiner som ...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Kjellermembranen er avgjørende for vev og organmorfogenese under utvikling. For bedre å forstå mekanismene som fører til riktig plassering av denne strukturen, beskriver protokollen som presenteres metoder for å visualisere og karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner i epitelceller ved hjelp av konfomisk og superoppløselig mikroskopi.

Confocal og Super-Resolution Imaging av polarisert intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner under Drosophila Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Denne protokollen tillater karakterisering av intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner ved hjelp av Drosophila-matrisen som modellsystem. Den største fordelen med teknikken vår er at den tillater høyoppløselig avbildning av intracellulær smugling av kjellermembranproteiner ved hjelp av endogene merkede proteiner og Airyscan superoppløselig mikroskopi. Selv om denne protokollen er utviklet for å avbilde intracellulær smugling av kjellermembranproteiner, kan den utvides til å studere smugling av andre proteiner av interesse og andre biologiske systemer, inkludert cellekultur og organoider.Til å begynne med, etter å ha dissekert Drosophila eggstokkene i PBS under et dissekeringsomfang, legg til en milliliter fikseringsløsning og fest eggstokkene på en næringsplattform i 15 minutter. Fjern fikseringsløsningen og utfør to raske vasker, hver med en milliliter PBST. Ved å forsiktig invertere mikrocentrifugerørene fem til seks ganger, utfør deretter fire lange vasker på 10 minutter hver med en milliliter PBST på en muteringsplattform rocker.Etter å ha utført fiksering og vasking, fjern PBST, legg deretter til en milliliter blokkeringsløsning og blokker eggstokkene på en næringsplattform rocker i minst en time. Deretter fjerner du blokkeringsløsningen og tilsett 300 mikroliter primær antistoffløsning, som inneholder primære antistoffer fortynnet ved deres passende konsentrasjoner i blokkeringsløsning. Inkuber over natten på en nøtteplattform rocker ved 4 grader Celsius.Etter å ha fjernet den primære antistoffløsningen, utfør to raske vasker og fire lange vasker, som vist tidligere, fjern deretter PBST og tilsett 500 mikroliter sekundær antistoffløsning som inneholder fluorescerende sekundære antistoffer som vil oppdage de primære antistoffene som brukes. Inkuber eggstokkene i den sekundære antistoffløsningen på en muteringsplattform rocker i to timer ved romtemperatur, utfør deretter to raske vasker og fire lange vasker i PBST som vist tidligere på en nøtteplattform rocker. Etter siste vask, bruk en P-1000 pipette for å forsiktig pipette eggstokkene opp og ned i røret for å skille eggkamrene.La eggkamrene synke til bunnen ved å holde røret i oppreist stilling i fem til ti minutter. Deretter fjerner du PBST ved hjelp av en Pasteur-pipette, og etterlater omtrent 50 mikroliter. Deretter fjerner du så mye av den gjenværende PBST som mulig ved hjelp av en P-200 pipette og legger til to dråper monteringsmedium, nok til å spre seg jevnt på en dekselslipp.For å muliggjøre enkel overføring av det viskøse monteringsmediet til sklien fra mikrosenterrøret, kutt av enden av en P-200 pipettespiss. Deretter overfører du sakte alle eggkamrene i monteringsmediet til glasssklie, og sikrer ikke å lage bobler. Under et dissekerende mikroskop sprer du forsiktig ut monteringsmediet og separerte eggkamrene ved hjelp av en ny P-200 pipettespiss eller tang for å dekke et område omtrent på størrelse med en dekselglidning.Bruk tang, plasser forsiktig dekselslippet på eggkamrene i en vinkel for å unngå bobler og lagre lysbildet ved romtemperatur på en flat overflate i mørket i to dager for å polymerisere. Når monteringsmediet er herdet, kan lysbildet lagres ved 4 grader Celsius i mørket i noen uker for avbildning. For å visualisere den intracellulære lokaliseringen av kjellermembranproteiner, sett målet til 63x og legg forsiktig en dråpe nedsenkningsolje på linsen, og plasser deretter lysbildet på målet med dekselslippet vendt mot målet om å finne prøven.Finn interesseområdet ved hjelp av okularet til det epifluorescerende mikroskopet, og velg deretter en konfigurasjon med passende innstillinger for fluoroforene til bildet som beskrevet i manuskriptet. Når konfigurasjonen er angitt, kan du se for eksempelet ved å velge Live under anskaffelsesmodus og justere zoomen mellom 2 og 4x for å optimalisere skanneområdet i prøven. For hver enkelt kanal velger du et spor under Kanal og klikker på Live.Juster masterforsterkningen og laserkraften mens du bruker områdeindikatorverktøyet, og følg alle retningslinjene for å unngå mettede bildepunkter som beskrevet i manuskriptet, samtidig som du gjentar det samme for hver kanal. I vekslevinduet for anskaffelsesmodus, under Bildestørrelse, klikker du på SR for å maksimere detektorens evner og justere rammestørrelsen automatisk. Hold gjennomsnittet til Ingen i airyscan-modus, da det vanligvis ikke er nødvendig og vil redusere skannetiden.I noen tilfeller kan imidlertid et gjennomsnitt på 2x forbedre signal-til-støy-forholdet, og deretter klikke på Snap for å skaffe et bilde. For å skaffe deg en Z-stabel, klikk på Z-Stack-avkrysningsruten under Kategorien Oppkjøp. Velg deretter ønsket kanal for å observere prøven.For eksempel DAPI-kanalen og klikk på Live for å starte en live scan, og angi deretter et område for Z-stabelen ved hjelp av finjusteringsknappen på mikroskopet. Deretter angir du endepunktene for Z-stakken ved å klikke Angi første og Angi siste. For optimal 3D-rekonstruksjon, angi intervallet for Z-stabelen lavere enn 0,5 mikrometer for å tilordne trinnstørrelsen og klikk på Start eksperiment for å starte Z-stack-oppkjøpet.Når bildene eller Z-stakken er oppnådd, klikker du på Processing, deretter Method-alternativet og velger Airyscan Processing. Utfør automatisk filter for å starte, og utfør om nødvendig ytterligere manuell behandling ved å endre superoppløsningsverdien for å oppnå de beste resultatene for eksemplet. Når den optimale SR-verdien er bestemt, klikker du på Bruk for å generere et behandlet bilde.Når det gjelder Z-stack-bilder, behandle enten som en Z-stykke eller som hele Z-stakken ved å klikke på 3D-prosesseringsboksen. For å visualisere proteinhandel i 3D etter oppkjøpet av en Z-stabel, generer et 3D-bilde ved å klikke på 3D-ikonet i forhåndsvisningsvinduet, som vises i visningskontrolldelen av Airyscan-behandlet bilde. Fra de forskjellige 3D-visningsalternativene bruker du Surface- eller Mixed-visninger når du viser strukturen til vesicles.Hvis du vil ha bildet av høyeste kvalitet, velger du Nøyaktig-innstillingen fordi innstillingen Raskest vil være mindre nøyaktig og føre til dårlig 3D-gjengivelse. Når bildet er generert, manipulerer du 3D-bildet ved å zoome og rotere for å fokusere på et foretrukket sted. Etter at visningen er oppnådd, velger du Vist oppløsning under 3D-fanen, og deretter klikker du på Opprett bilde, som vil opprette et øyeblikksbilde av bildet i samme retning som det ble vist og kan lagres og eksporteres i forskjellige filformater.Konfektmikroskopi kan brukes til å visualisere intracellulær lokalisering og avsetning av kjellermembranproteiner som Viking-GFP når oppkjøpsparametrene er optimalisert. Når anskaffelse og bildebehandling utføres riktig, øker mikroskopien med superoppløsning bildeoppløsningen sammenlignet med konfomisk mikroskopi. Som illustrert av de bedre definerte bildene i intracellulær smugling av kjellermembranproteiner, som Viking.Ortogonal projeksjon gjør det mulig å visualisere den totale fordelingen av vesikler og rom som inneholder kjellermembranproteiner i ett enkelt bilde ved hjelp av konfokal eller superoppløsningsavbildning. En 3D-rekonstruksjon ved å sette sammen en stabel med optiske Z-seksjoner tatt av konfokal eller superoppløsningsavbildning ble brukt til å vurdere lokalisering og distribusjon av intracellulære kjellermembranproteiner. Superoppløsningsavbildning kan brukes til å bestemme nøyaktig lokalisering av kjellermembranproteiner under mutante forhold.For eksempel, i Crag knockdown epitelceller, akkumuleres kjellermembranproteiner både apically og basally, noe som indikerer at den styrer polarisert sekresjon av kjellermembranproteiner. Konfølende mikroskopi og superoppløsningsmikroskopi kan også brukes i samlokaliseringseksperimenter. For eksempel viser denne figuren delvis samlokalisering av Viking-GFP og en Golgi-markør, GM-130, som bekrefter at Viking er sortert til Golgi før sekresjon.For å effektivt avbilde smuglingen av kjellermembranproteiner ved hjelp av mikroskopi med superoppløsning, anbefaler vi å montere eggstokkene nøye og være spesielt oppmerksom når du setter oppkjøpet og konvolusjonsparametrene. Denne protokollen er optimalisert for å visualisere intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner. Det kan imidlertid enkelt modifiseres for å effektivt avbilde smugling av andre proteiner av interesse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Confocal Imaging av Developing Arabidopsis blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som modell for intracellulær Lumen Morphogenesis og I Vivo polarisert membran Biogenesis i en enkeltcelle: merking av GFP-fusjoner, RNAi interaksjon skjermen og bildebehandling

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder for Imaging intracellulær pH i hårsekken stamcelleforskningen slektslinje i Live Drosophila Ovarian vev

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Analyse av Epididymal proteinsyntese og sekresjon

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Bildebehandling og analyse av vevsorientering og vekstdynamikk i developing Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualisering av Cytoskeleton-avhengig smugling av lipidholdige organeller i Drosophila embryoer

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Bruk av ekspansjonsmikroskopi for fysisk å forstørre helmonterte Drosophila-embryoer for superoppløsningsavbildning

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...