Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Os autores são gratos a Julie Merkle por seus comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R15GM137236 para O.D. As imagens confocal e super-resolução foram adquiridas utilizando um Zeiss LSM 900 com Airyscan 2, comprado com 2018748 de subvenção de ressonância magnética da NSF.

1. Preparação de moscas para dissecções de ovário
<ol><li>Coloque 10-15 moscas fêmeas de melanogaster Drosophila (1-2 dias de idade) do genótipo desejado em um frasco estreito contendo ~8 mL de mosca drosophila granulado com uma pequena quantidade de levedura granulada 2-3 dias antes da dissecção a 25 °C. Adicionar alguns machos ao frasco pode aumentar a produção de câmara de ovos. No entanto, certifique-se de que o número total de moscas não exceda 20, pois isso pode ...

O BM é fundamental para morfogênese embrionária e de órgãos, e funções fisiológicas adultas. Além disso, o BM atua como uma plataforma de sinalização para o estabelecimento e manutenção da polaridade epitelial e fornece tecidos com suporte2. No entanto, os mecanismos que regulam a colocação adequada das proteínas BM são mal compreendidos. Uma melhor compreensão das vias biológicas dedicadas ao tráfico intracelular e à secreção polarizada das proteínas BM requer uma análise...

A membrana do porão (BM) é uma fina folha de matriz extracelular aderente a células em camadas (ECM) crítica para estrutura epitelial e morfogênese1. Compreende ~50 proteínas e é encontrado onipresentemente subjacente às células epiteliais e endoteliais, e células esqueléticas, lisas e cardíacas e adipócitos 1,2,3. Os três principais componentes do BM no lado basal das células epiteliais são Colágeno IV, Perlecan e Laminins. O BM está por trás das células epiteliais e é responsável por muitas funções, incluindo separação e barreira tecidual, crescimento e suporte, e polarização celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Seu papel como plataforma de sinalização regula a morfologia e diferenciação de células e tecidos epiteliais durante o desenvolvimento 3,13,14. Além disso, a má regulação do BM e/ou uma violação de sua integridade são as principais causas de muitas condições patológicas, incluindo a metástase tumoral 2,15,16. Apesar das funções essenciais desempenhadas pelo MMC durante a morfogênese tecidual e de órgãos, os componentes da via biológica dedicada ao tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas BM são vagamente conhecidos.
Para estudar o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e a secreção de proteínas BM por células epiteliais, o epitélio folicular (FE) do ovário de Drosophila é um poderoso sistema modelo (Figura 1). Um ovário de Drosophila compreende 16-20 estruturas longas, semelhantes a tubos, chamadas ovários (Figura 1A,B)17,18,19. Cada ovário pode ser considerado como uma linha de montagem de ovos, com a progressão de idade das câmaras de ovos (que cada uma dá origem a um ovo) que começa na extremidade anterior e se move posteriormente, até que o ovo maduro saia através do oviduto. Cada câmara de ovo é encapsulada pela FE, uma monocamada de células folículos somáticas (FCs), que circunda as células germinais centrais (GCs). O FE é altamente polarizado com uma distinta polaridade apical-basal onde o domínio apical enfrenta a germinal, e as proteínas BM são secretas basally 18,19. Os FCs secretam ativamente todos os principais componentes do BM, incluindo Colágeno IV, Perlecan e Laminins20,21. Em células epiteliais como FCs, os componentes de BM são produzidos e requerem um caminho de secreção polarizada especializada para sua deposição extracelularmente. Por exemplo, no caso do componente mais abundante do BM, Colágeno IV (Coll IV), os detalhes em torno de seu tráfico intracelular polarizado e secreção são vagos, apesar de sua produção e deposição serem o foco de muitos estudos. A coll IV é traduzida no ânticulo endoplasmático (ER), que também é onde cada fibril - composto por três polipeptídeos (duas cadeias α1 e uma cadeia α2) - é montado em uma hélice tripla22. A dobra e a função adequadas coll IV requerem acompanhantes e enzimas ER, incluindo lysyl e prolyl-hidroxilases como Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Essas enzimas pós-transacionais regulam a classificação do ER de Coll IV, pois a perda de cada uma faz com que o Coll IV fique preso no ER basal 20,23,24,25,26. Em seguida, o recém-sintetizado Coll IV sai do ER para o Golgi em vesículas revestidas de COPII. O receptor de carga Tango1 auxilia na embalagem de collagens em vesículas consideráveis ligadas a Golgi que podem acomodar grandes proteínas multiméricas20,27. Uma vez que Coll IV é embalado em vesículas exocóis exocóis intracelulares, é especificamente secretado basalmente de células epiteliais. Para direcionar a deposição de BM para o lado basal, as células epiteliais requerem outro conjunto de fatores especificamente dedicados à secreção polarizada de BM. Usando o FE do ovário Drosophila, alguns componentes deste novo processo celular foram caracterizados, incluindo os fatores de troca de nucleotídeos (GEFs) Crag e Stratum, os GTPases Rab8 e Rab10, bem como os níveis do fosfoinostito PI(4,5)P2, e Kinesin 1 e 3 proteínas motoras 20,28,29, 30,31 . Esses componentes são fundamentais para garantir a distribuição polarizada das proteínas BM.
Para monitorar a localização intracelular de proteínas BM no FE, proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente (armadilhas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP) podem ser utilizadas 32,33. Estas linhas de armadilhas proteicas têm sido demonstradas para refletir com precisão a distribuição endógena das proteínas BM e permitir uma detecção mais sensível do tráfico vesicular28,30. Os componentes envolvidos na deposição polarizada de BM no FE foram caracterizados pela primeira vez utilizando linhas de armadilha de proteína para Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Armadilhas proteicas podem ser usadas em diferentes origens genéticas, incluindo mutantes e linhas Gal4 34. Além disso, armadilhas proteicas podem ser usadas em combinação com corantes fluorescentes e/ou imunostaining de fluorescência, permitindo uma caracterização precisa da localização de proteínas BM ao comparar condições do tipo selvagem e mutantes35.
Avaliar com precisão e eficiência a distribuição e localização de vesículas contendo proteínas BM, microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) e técnicas de imagem de super resolução apresentam uma vantagem significativa para outras abordagens de imagem. Estas abordagens acoplam imagens de alta resolução com relativa facilidade de uso. CLSM é uma técnica de microscopia que permite uma melhor resolução óptica escaneando a amostra com um laser em uma maneira de varredura raster usando galvanômetros. A abertura do pinhole é um componente central de um microscópio confocal. Bloqueando os sinais fora de foco provenientes de cima ou abaixo do plano focal, a abertura do pinhole resulta em uma resolução altamente superior no eixo z36. Isso também permite obter uma série de imagens no plano z, chamada de pilha z, correspondente a uma série de seções ópticas. z-stacks posteriormente criar uma imagem 3D do espécime, através de reconstrução 3D, com o auxílio de software de imagem. Microscópios convencionais de epifluorescência (widefield), ao contrário dos microscópios confocal, permitem que a luz fora de foco contribua para a qualidade da imagem, diminuindo a resolução da imagem e o contraste36,37. Isso torna a microscopia de epifluorescência um candidato menos atraente ao estudar localização ou colocalização de proteínas.
Embora o CLSM seja uma abordagem adequada para várias aplicações, incluindo imagem e caracterização do tráfico intracelular de proteínas BM, ele ainda apresenta um problema quando amostras de imagem abaixo do limite de difração de luz de Abbe (200-250 nm). Ao fotografar tais amostras, a microscopia confocal, especialmente quando se utiliza um objetivo de óleo, pode resultar em alta resolução. No entanto, as técnicas de super-resolução ultrapassam o limite da microscopia confocal. Existem várias abordagens para alcançar microscopia de super-resolução, cada uma com limites de resolução específicos, e cada uma apropriada para diferentes análises. Essas abordagens incluem microscopia de localização fotoativada (PALM) ou microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de esgotamento de emissões estimulada (STED), microscopia de iluminação estruturada (SIM) e microscopia airyscana (super-resolução) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Embora o Airyscan tenha uma resolução mais grosseira que PALM/STORM, STED e SIM, ele ainda pode alcançar uma resolução de até ~120 nm (cerca de duas vezes a resolução do CLSM). Além disso, essa abordagem de microscopia de super resolução tem mostrado ter uma vantagem sobre o SIM e outras técnicas de super-resolução ao fotografar amostras grossas e amostras com uma baixa relação sinal-ruído47,48.
Airyscan é uma tecnologia de microscopia confocal relativamente nova46. Ao contrário dos CLSMs tradicionais, que usam o pinhole e os detectores de ponto único para rejeitar a luz fora de foco, esta abordagem de super-resolução usa um detector de área de tubo de arsultipto de arsênio de 32 canais (GaAsP) que coleta toda a luz em cada posição de varredura45. Cada um dos 32 detectores funciona como um pequeno pinhole, reduzindo o tamanho do pinhole da tradicional Unidade Aérea 1.0 (A.U.) para um 0,2 A.U., permitindo uma resolução ainda maior e relação sinal-ruído, mantendo a eficiência de um diâmetro de 1,25 A.U., 45. Além disso, a desconvolução linear usada pelo Airyscan resulta em até um aumento de 2x na resolução45. Levando isso em consideração, o CLSM, e especificamente a microscopia de super resolução, são adequados para estudar proteínas e proteínas de BM que regulam a deposição basal das proteínas BM, pois podem produzir imagens de alta resolução para estudos de localização e colocalização, fornecendo assim novas percepções nos eventos espaciais, temporais e moleculares que controlam esses processos.
Uma abordagem alternativa à microscopia confocal que pode ser usada para realizar experimentos de localização é a desconvolução de imagens. Uma vez que a microscopia widefield permite que a luz fora de foco atinja os detectores, algoritmos matemáticos e de desconvolução computacional podem ser aplicados para remover ou recoltir a luz fora de foco das imagens obtidas pela microscopia de campo largo, melhorando assim a resolução e o contraste da imagem49. Algoritmos de desconvolução também podem ser aplicados a imagens confocal para aumentar ainda mais a resolução e o contraste, produzindo imagens finais quase comparáveis à da microscopia de super resolução50. Airyscan faz uso da desconvolução baseada em filtro Weiner, juntamente com a redesignação de pixels de Sheppard, resultando em uma resolução espacial altamente melhorada e relação sinal-ruído. Em comparação com a microscopia confocal, observa-se um aumento de 2x em resolução nas três dimensões espaciais (120 nm em x e y, e 350 nm em z) ao utilizar esta técnica de microscopia de super resolução45,51.
Este manuscrito fornece protocolos detalhados e otimizados para manchar, adquirir e visualizar o tráfico intracelular e a deposição de proteínas BM utilizando o FE do ovário Drosophila como um sistema modelo aliado à microscopia confocal e super-resolução. As linhas de drosophila que expressam proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente, por exemplo, Vkg-GFP e Pcan-GFP, são ferramentas eficientes e precisas para visualizar o tráfico e a secreção de proteínas BM. Além disso, eles podem ser facilmente usados em diferentes origens genéticas, incluindo as linhas mutante e Gal4/UAS 34. Embora proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente sejam recomendadas, o uso de anticorpos contra proteínas BM específicas também é compatível com os protocolos descritos. Esses protocolos são particularmente úteis para cientistas interessados em estudar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas BM em tecido epitelial intacto usando imagens confocal e super-resolução. Além disso, a capacidade de combinar a análise do tecido epitelial com as ferramentas expansivas da genética drosophila torna essa abordagem especialmente poderosa. Finalmente, esses protocolos poderiam ser facilmente adaptados para estudar o tráfico vesicular e a triagem de outras proteínas de interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

A membrana do porão (ML) - uma folha especializada de matriz extracelular presente no lado basal das células epiteliais - é fundamental para o estabelecimento e manutenção da morfologia do tecido epitelial e da morfogênese do órgão. Além disso, o BM é essencial para a modelagem tecidual, servindo como uma plataforma de sinalização, e fornecendo forças externas para moldar tecidos e órgãos. Apesar dos muitos papéis importantes que o BM desempenha durante o desenvolvimento normal e as condições patológicas, as vias biológicas que controlam o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e como a secreção basal leva à deposição polarizada das proteínas BM são mal compreendidas. O epitélio folicular do ovário Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar a deposição basal de proteínas de membrana BM, pois produz e secreta todos os principais componentes do ovário BM. A imagem confocal e super-resolução combinada com o processamento de imagens em tecidos fixos permite a identificação e caracterização de fatores celulares especificamente envolvidos no tráfico intracelular e na deposição de proteínas BM. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para coloração e imagem de vesículas contendo BM e BM depositado usando proteínas marcadas endogenosamente no epitélio folicular do ovário de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado para abordar questões qualitativas e quantitativas e foi desenvolvido para acomodar a triagem de alto rendimento, permitindo a identificação rápida e eficiente dos fatores envolvidos no tráfico intracelular polarizado e secreção de vesículas durante o desenvolvimento do tecido epitelial.

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para imagem eficiente e precisa e caracterizar o tráfico intracelular e secreção de proteínas BM em células epiteliais polarizadas, como a FE do ovário de Drosophila . Em seguida, fornecemos resultados antecipados obtidos usando os métodos descritos, bem como conselhos úteis e potenciais armadilhas. Para isso, é utilizado O Vkg-GFP, um Vkg com etiqueta endógena (Drosophila Col IV). No entanto, os mesmos resultados podem ser alcançados com outras...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

A membrana do porão é essencial para morfogênese tecidual e órgão durante o desenvolvimento. Para entender melhor os mecanismos que levam à colocação adequada dessa estrutura, o protocolo apresentado descreve métodos para visualizar e caracterizar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas de membrana de porão em células epiteliais utilizando microscopia confocal e super-resolução.

Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Este protocolo permite a caracterização do tráfico intracelular e secreção de proteínas de membrana de porão usando a matriz Drosophila como sistema modelo. A principal vantagem de nossa técnica é que ela permite imagens de alta resolução do tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão usando proteínas endógenas marcadas e microscopia de super-resolução airyscan. Embora este protocolo seja desenvolvido para imaginar o tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão, pode ser estendido para estudar o tráfico de outras proteínas de interesse e outros sistemas biológicos, incluindo cultura celular e organoides.Para começar, depois de dissecar os ovários de Drosophila em PBS sob um escopo dissecando, adicione um mililitro de solução de fixação e fixe os ovários em uma plataforma de nozes por 15 minutos. Remova a solução de fixação e realize duas lavagens rápidas, cada uma com um mililitro de PBST. Invertendo suavemente os tubos de microcentrifuuge cinco a seis vezes, em seguida, executar quatro lavagens longas de 10 minutos cada com um mililitro de PBST em um roqueiro de plataforma nutating.Depois de realizar a fixação e lavagem, remova o PBST e adicione um mililitro da solução de bloqueio e bloqueie os ovários em um roqueiro de plataforma de nozes por pelo menos uma hora. Em seguida, remova a solução de bloqueio e adicione 300 microliters de solução primária de anticorpos, contendo anticorpos primários diluídos em suas concentrações apropriadas na solução de bloqueio. Incubar durante a noite em um roqueiro de plataforma de nozes a 4 graus Celsius.Depois de remover a solução primária de anticorpos, realize duas lavagens rápidas e quatro lavagens longas, como demonstrado anteriormente, depois remova o PBST e adicione 500 microliters de solução de anticorpos secundários contendo anticorpos secundários fluorescentes que detectarão os anticorpos primários utilizados. Incubar os ovários na solução secundária de anticorpos em um roqueiro de plataforma por duas horas à temperatura ambiente, em seguida, realizar duas lavagens rápidas e quatro lavagens longas em PBST, como demonstrado anteriormente em um roqueiro de plataforma de nozes. Após a última lavagem, use uma pipeta P-1000 para cochilar suavemente os ovários para cima e para baixo no tubo para separar as câmaras de ovos.Deixe as câmaras de ovos afundarem até o fundo mantendo o tubo em posição vertical por cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o PBST usando uma pipeta Pasteur, deixando aproximadamente 50 microliters. Depois, remova o máximo possível do PBST restante usando uma pipeta P-200 e adicione duas gotas de meio de montagem, o suficiente para se espalhar uniformemente em um deslizamento de cobertura.Para permitir a fácil transferência do meio de montagem viscoso para o slide do tubo de microcentrifuutura, corte a extremidade de uma ponta de pipeta P-200. Em seguida, transfira lentamente todas as câmaras de ovos no meio de montagem para o escorregador de vidro, garantindo não criar bolhas. Sob um microscópio dissecando, espalhe suavemente a mídia de montagem e as câmaras de ovos separadas usando uma nova ponta de pipeta P-200 ou fórceps para cobrir uma área aproximadamente do tamanho de um deslizamento de cobertura.Usando fórceps, coloque cuidadosamente o deslizamento de cobertura nas câmaras de ovos em um ângulo para evitar bolhas e armazene o slide à temperatura ambiente em uma superfície plana no escuro por dois dias para polimerizar. Uma vez que a mídia de montagem tenha curado, o slide pode ser armazenado a 4 graus Celsius no escuro por algumas semanas para imagens. Para visualizar a localização intracelular das proteínas da membrana do porão, defina o objetivo para 63x e coloque suavemente uma gota de óleo de imersão em sua lente, em seguida, posicione o slide sobre o objetivo com o deslizamento de tampa voltado para o objetivo de localizar a amostra.Localize a região de interesse usando a ocular do microscópio epifluorescente e selecione uma configuração com configurações apropriadas para os fluoroforos à imagem conforme descrito no manuscrito. Uma vez definida a configuração, imagem a amostra selecionando Live under Acquisition Mode e ajuste o zoom entre 2 e 4x para otimizar a área de varredura da amostra. Para cada canal individual, selecione uma faixa em Canal e clique em Live.Ajuste o ganho mestre e a potência do laser ao usar a ferramenta indicador de alcance e siga todas as diretrizes para evitar pixels saturados como descrito no manuscrito, enquanto repete o mesmo para cada canal. Na janela de alternar o modo de aquisição, em tamanho de imagem, clique em SR para maximizar as capacidades do detector e ajuste o tamanho do quadro automaticamente. Mantenha a média de Nenhum no modo Airyscan, pois geralmente não é necessário e diminuirá o tempo de varredura.No entanto, em alguns casos, uma média de 2x pode melhorar a relação sinal-ruído e, em seguida, clique no Snap para adquirir uma imagem. Para adquirir uma pilha Z, clique na caixa de seleção Z-Stack na guia Aquisição. Em seguida, selecione o canal desejado para observar o espécime.Por exemplo, o canal DAPI e clique em Live para iniciar uma varredura ao vivo e, em seguida, defina um intervalo para a pilha Z usando o botão de ajuste fino no microscópio. Depois, defina os pontos finais da pilha Z clicando em Definir Primeiro e Definir Por Último. Para uma reconstrução 3D ideal, defina o intervalo para a pilha Z inferior a 0,5 micrômetros para atribuir o tamanho da etapa e clique em Iniciar Experimento para iniciar a aquisição da pilha Z.Uma vez obtidas as imagens ou pilha Z, clique na opção Processamento e selecione Processamento airyscan. Execute o Filtro Automático para iniciar e, se necessário, realize mais processamento manual alterando o valor da super resolução para obter os melhores resultados para a amostra. Após a determinação do valor de RS ideal, clique em Aplicar para gerar uma imagem processada.No caso de imagens de pilha Z, processe como uma fatia Z ou como toda a pilha Z clicando na caixa de processamento 3D. Para visualizar o tráfico de proteínas em 3D após a aquisição de uma pilha Z, gere uma imagem 3D clicando no ícone 3D na janela de visualização, que aparecerá na seção de controle de exibição da imagem processada airyscan. Das diferentes opções de visualização 3D, use visualizações surface ou mistas ao visualizar a estrutura de vesículas.Para obter a imagem de alta qualidade, selecione a configuração Precisa, pois a configuração Mais rápida será menos precisa e levará a uma má renderização 3D. Uma vez gerada a imagem, manipule a imagem 3D ampliando e girando para se concentrar em um local preferido. Depois que a exibição for obtida, sob a guia 3D, selecione Resolução exibida e, em seguida, clique em Criar imagem, que criará um instantâneo da imagem na mesma orientação que foi visualizada e pode ser salva e exportada em vários formatos de arquivo.A microscopia confocal pode ser usada para visualizar a localização intracelular e a deposição de proteínas de membrana de porão, como a Viking-GFP, quando os parâmetros de aquisição são otimizados. Quando a aquisição e o processamento de imagens são realizados corretamente, a microscopia de super-resolução aumenta a resolução da imagem em comparação com a microscopia confocal. Como ilustrado pelas imagens mais bem definidas no tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão, como a Viking.A projeção ortogonal permite a visualização da distribuição global de vesículas e compartimentos contendo proteínas de membrana de porão em uma única imagem usando imagens confocal ou super-resolução. Uma reconstrução 3D montando uma pilha de seções ópticas Z tomadas por imagens confocal ou super-resolução foi empregada para avaliar a localização e distribuição de proteínas de membrana de porão intracelular. Imagens de super-resolução podem ser usadas para determinar a localização precisa de proteínas de membrana de porão em condições mutantes.Por exemplo, em células epiteliais de knockg, as proteínas da membrana do porão se acumulam tanto apicamente quanto basally, indicando que controla a secreção polarizada das proteínas da membrana do porão. A microscopia confocal e super-resolução também podem ser empregadas em experimentos de co-localização. Por exemplo, este número mostra a co-localização parcial do Viking-GFP e um marcador Golgi, GM-130, confirmando que viking é classificado para o Golgi antes da secreção.Para visualizar eficientemente o tráfico de proteínas de membrana de porão usando microscopia de super-resolução, recomendamos montar cuidadosamente os ovários e ter especial atenção ao definir os parâmetros de aquisição e convolução. Este protocolo é otimizado para visualizar o tráfico intracelular e a secreção das proteínas da membrana do porão. No entanto, pode ser facilmente modificado para imaginar eficientemente o tráfico de outras proteínas de interesse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Biologia do Desenvolvimento

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

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Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

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Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

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Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...