Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Yazarlar, Julie Merkle'ye el yazması hakkındaki yararlı yorumları için minnettardır. Bu çalışma, O.D.'ye NIH hibe R15GM137236 tarafından desteklenmiştir. Konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüler, NSF MRI hibe 2018748 ile satın alınan Airyscan 2'li bir Zeiss LSM 900 kullanılarak elde edildi.

1. Yumurtalık diseksiyonları için sinek hazırlığı
<ol><li>İstenilen genotipten 10-15 Drosophila melanogaster dişi sineğini (1-2 günlük), 25 ° C'de diseksiyondan 2-3 gün önce az miktarda granül fırıncı mayası serpilmiş ~ 8 mL Drosophila sinek ortamı içeren dar bir şişeye koyun. Şişeye birkaç erkek eklemek yumurta odası verimini artırabilir. Bununla birlikte, toplam sinek sayısının 20'yi geçmediğinden emin olun, çünkü bu yumurtalık gelişimini olu...

BM, embriyonik ve organ morfogenezi ve yetişkin fizyolojik fonksiyonları için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, BM, epitel polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi için bir sinyal platformu görevi görür ve dokulara destek2 sağlar. Bununla birlikte, BM proteinlerinin uygun şekilde yerleştirilmesini düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığına ve polarize sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların daha iyi anlaşılması, ...

Bodrum membranı (BM), epitel yapısı ve morfogenez1 için kritik olan katmanlı hücre yapışık hücre dışı matriksin (ECM) ince bir tabakasıdır. ~ 50 proteinden oluşur ve epitel ve endotel hücrelerinin altında her yerde bulunur ve iskelet, pürüzsüz ve kalp kası hücrelerini ve adipositleri 1,2,3 ile örter. BM'nin epitel hücrelerinin bazal tarafındaki üç ana bileşeni Kollajen IV, Perlekan ve Lamininlerdir. BM, epitel hücrelerinin temelini oluşturur ve doku ayrılması ve bariyeri, büyüme ve destek ve hücre polarizasyonu 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 dahil olmak üzere birçok fonksiyondan sorumludur. . Bir sinyal platformu olarak rolü, gelişim sırasında epitel hücrelerinin ve dokularının morfolojisini ve farklılaşmasını düzenler 3,13,14. Ayrıca, BM'nin yanlış düzenlenmesi ve / veya bütünlüğünün ihlali, tümör metastazı2,15,16 dahil olmak üzere birçok patolojik durumun birincil nedenleridir. BM tarafından doku ve organ morfogenezi sırasında gerçekleştirilen temel fonksiyonlara rağmen, BM proteinlerinin polarize hücre içi kaçakçılığına ve sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların bileşenleri belirsiz olarak bilinmektedir.
BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını ve BM proteinlerinin epitel hücreleri tarafından salgılanmasını incelemek için, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli (FE) güçlü bir model sistemdir (Şekil 1). Bir Drosophila yumurtalık, ovaroller adı verilen 16-20 uzun, tüp benzeri yapıdan oluşur (Şekil 1A, B)17,18,19. Her ovarol, ön uçta başlayan ve olgun yumurta kanalından çıkana kadar arkadan hareket eden yumurta odalarının (her biri bir yumurtaya yol açan) yaş ilerlemesiyle bir yumurta montaj hattı olarak düşünülebilir. Her yumurta odası, merkezi germline hücrelerini (GC'ler) çevreleyen somatik folikül hücrelerinin (FC'ler) tek katmanlı bir tabakası olan FE tarafından kapsüllenir. FE, apikal alanın germ hattına baktığı ve BM proteinlerinin bazal olarak18,19 salgılandığı belirgin bir apikal-bazal polarite ile oldukça polarize edilir. FC'ler, Kollajen IV, Perlecan ve Lamininler20,21 dahil olmak üzere BM'nin tüm ana bileşenlerini aktif olarak salgılar. FC'ler gibi epitel hücrelerinde, BM bileşenleri üretilir ve hücre dışı birikimleri için özel bir polarize sekresyon yolu gerektirir. Örneğin, BM'nin en bol bileşeni olan Kollajen IV (Coll IV) söz konusu olduğunda, polarize hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu çevreleyen detaylar, üretimi ve birikimi birçok çalışmanın odak noktası olmasına rağmen belirsizdir. Coll IV, endoplazmik retikulumda (ER) çevrilir, bu da her fibrilin - üç polipeptitten (iki α1 zinciri ve bir α2 zinciri) oluşan - üçlü bir sarmal22'ye monte edildiği yerdir. Uygun Coll IV katlama ve fonksiyonu, Plod ve PH4αEFB 20,22,23,24,25,26 gibi lizil ve prolil-hidroksilazlar dahil olmak üzere ER şaperonları ve enzimleri gerektirir. Bu posttranslasyonel enzimler, Coll IV'ün ER sıralamasını düzenler, çünkü her birinin kaybı, Coll IV'ün bazal ER20,23,24,25,26'da sıkışmasına neden olur. Daha sonra, yeni sentezlenen Coll IV, COPII kaplı veziküllerde Golgi için ER'den çıkar. Kargo reseptörü Tango1, kollajenlerin büyük multimerik proteinleri barındırabilen büyük Golgi'ye bağlı veziküllere paketlenmesine yardımcı olur20,27. Coll IV, hücre içi ekzositik veziküllere paketlendikten sonra, özellikle epitel hücrelerinden bazal olarak salgılanır. BM birikimini bazal tarafa yönlendirmek için, epitel hücreleri özellikle polarize BM sekresyonuna adanmış başka bir dizi faktöre ihtiyaç duyar. Drosophila yumurtalıklarının FE'sini kullanarak, nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) Crag ve Stratum, GTPazlar Rab8 ve Rab10'un yanı sıra fosfoinositid PI (4,5) P2 seviyeleri ve Kinesin 1 ve 3 motor proteinleri 20,28,29,30,31 dahil olmak üzere bu yeni hücresel sürecin birkaç bileşeni karakterize edilmiştir. . Bu bileşenler, BM proteinlerinin polarize dağılımını sağlamada kritik öneme sahiptir.
FE'deki BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu izlemek için, Viking-GFP (Vkg-GFP veya α2 Coll IV-GFP) ve Perlecan-GFP (Pcan-GFP) gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri (protein tuzakları)32,33 kullanılabilir. Bu protein tuzak hatlarının BM proteinlerinin endojen dağılımını doğru bir şekilde yansıttığı ve veziküler kaçakçılığın daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir 28,30. FE'de BM'nin polarize birikiminde rol oynayan bileşenler ilk olarak Vkg-GFP ve Pcan-GFP20,28,29,30 için protein tuzak hatları kullanılarak karakterize edildi. Protein tuzakları, mutantlar ve Gal4 hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kullanılabilir. Ayrıca, protein tuzakları floresan boyalar ve / veya floresan immünoboyama ile kombinasyon halinde kullanılabilir, bu da vahşi tip ve mutant koşulları karşılaştırırken BM proteinlerinin lokalizasyonunun kesin karakterizasyonuna izin verir35.
BM proteini içeren veziküllerin dağılımını ve lokalizasyonunu doğru ve verimli bir şekilde değerlendirmek için, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ve süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri diğer görüntüleme yaklaşımlarına önemli bir avantaj sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi göreceli kullanım kolaylığı ile birleştirir. CLSM, galvanometreler kullanarak numuneyi bir lazerle raster tarama tarzında tarayarak gelişmiş bir optik çözünürlüğe izin veren bir mikroskopi tekniğidir. İğne deliği açıklığı, konfokal mikroskopun temel bir bileşenidir. İğne deliği diyafram açıklığı, odak düzleminin üstünden veya altından gelen odak dışı sinyalleri engelleyerek, z ekseni36'da oldukça üstün bir çözünürlük sağlar. Bu aynı zamanda z-düzleminde, bir dizi optik bölüme karşılık gelen z-yığını adı verilen bir dizi görüntü elde etmeyi mümkün kılar. z-yığınları daha sonra görüntüleme yazılımı yardımıyla 3D rekonstrüksiyon yoluyla numunenin 3D görüntüsünü oluşturur. Geleneksel epifloresan (geniş alan) mikroskoplar, konfokal mikroskopların aksine, odak dışı ışığın görüntü kalitesine katkıda bulunmasına izin vererek görüntü çözünürlüğünü ve kontrastıazaltır 36,37. Bu, epifloresan mikroskopisini protein lokalizasyonu veya kolokalizasyonu üzerinde çalışırken daha az çekici bir aday haline getirir.
CLSM, BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin görüntülenmesi ve karakterizasyonu da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygun bir yaklaşım olmasına rağmen, Abbe'nin ışık kırınım sınırının (200-250 nm) altındaki örnekleri görüntülerken hala bir sorun teşkil etmektedir. Bu tür örnekleri görüntülerken, konfokal mikroskopi, özellikle bir yağ hedefi kullanırken, yüksek çözünürlükle sonuçlanabilir. Bununla birlikte, süper çözünürlük teknikleri konfokal mikroskopinin sınırını aşmaktadır. Süper çözünürlüklü mikroskopi elde etmek için, her biri belirli çözünürlük sınırlarına sahip ve her biri farklı analizler için uygun olan çeşitli yaklaşımlar vardır. Bu yaklaşımlar arasında fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ve Airyscan (süper çözünürlük) mikroskobu 38,39,40,41,42,43,44,45,46 bulunmaktadır. . Airyscan, PALM / STORM, STED ve SIM'den daha kaba bir çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, yine de ~ 120 nm'ye kadar bir çözünürlüğe ulaşabilir (CLSM'nin çözünürlüğünün yaklaşık iki katı). Ayrıca, bu süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımının, kalın numuneleri ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip numuneleri görüntülerken SIM ve diğer süper çözünürlüklü tekniklere göre bir avantajı olduğu gösterilmiştir47,48.
Airyscan nispeten yeni bir süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi teknolojisidir46. Odak dışı ışığı reddetmek için iğne deliği ve tek nokta dedektörlerini kullanan geleneksel CLSM'lerin aksine, bu süper çözünürlüklü yaklaşım, her tarama konumunda tüm ışığı toplayan 32 kanallı galyum arsenit fosfit (GaAsP) fotoçarpan tüp alanı dedektörü kullanır45. 32 dedektörün her biri küçük bir iğne deliği olarak çalışarak iğne deliği boyutunu geleneksel 1,0 Havadar Üniteden (A.U.) gelişmiş 0,2 A.U.'ya düşürerek 1,25 A.U. çapı45'in verimliliğini korurken daha da yüksek bir çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, Airyscan tarafından kullanılan doğrusal dekonvolüsyon,45 çözünürlüğünde 2 kata kadar artışa neden olur. Bunu göz önünde bulundurarak, CLSM ve özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, BM proteinlerinin bazal birikimini düzenleyen BM proteinlerini ve proteinlerini incelemek için çok uygundur, çünkü lokalizasyon ve kolokalizasyon çalışmaları için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilirler, böylece bu süreçleri kontrol eden mekansal, zamansal ve moleküler olaylarda yeni bilgiler sağlayabilirler.
Lokalizasyon deneyleri yapmak için kullanılabilecek konfokal mikroskopiye alternatif bir yaklaşım, görüntü dekonvolüsyonudur. Geniş alan mikroskobu, odak dışı ışığın dedektörlere ulaşmasına izin verdiğinden, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntülerden odak dışı ışığı çıkarmak veya yeniden atamak için matematiksel ve hesaplamalı dekonvolüsyon algoritmaları uygulanabilir, böylece görüntünün çözünürlüğünü ve kontrastını artırabilir49. Dekonvolüsyon algoritmaları, çözünürlüğü ve kontrastı daha da artırmak için konfokal görüntülere de uygulanabilir ve neredeyse süper çözünürlüklü mikroskopi50 ile karşılaştırılabilir nihai görüntüler üretir. Airyscan, Sheppard'ın piksel yeniden atamasıyla birlikte Weiner filtre tabanlı dekonvolüsyondan yararlanır ve bu da oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği 45,51 kullanıldığında, her üç uzamsal boyutta (x ve y'de 120 nm ve z'de350 nm) çözünürlükte 2 kat artış gözlenmiştir.
Bu makale, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birleştirilmiş bir model sistem olarak Drosophila yumurtalık FE'sini kullanarak BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve birikimini boyamak, elde etmek ve görselleştirmek için ayrıntılı ve optimize edilmiş protokoller sunmaktadır. Vkg-GFP ve Pcan-GFP gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinlerini ifade eden Drosophila çizgileri, BM protein kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için etkili ve doğru araçlardır. Ek olarak, mutant ve Gal4 / UAS hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kolayca kullanılabilirler. Endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri önerilmekle birlikte, spesifik BM proteinlerine karşı antikorların kullanımı da tarif edilen protokollerle uyumludur. Bu protokoller, konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak hücre içi kaçakçılığı ve bozulmamış epitel dokusunda BM proteinlerinin salgılanmasını incelemek isteyen bilim adamları için özellikle yararlıdır. Dahası, epitel doku analizini Drosophila genetiğinin geniş araçlarıyla birleştirme yeteneği, bu yaklaşımı özellikle güçlü kılmaktadır. Son olarak, bu protokoller veziküler kaçakçılığı ve ilgilenilen diğer proteinlerin sıralanmasını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

Epitel hücrelerinin bazal tarafında bulunan özel bir hücre dışı matriks tabakası olan bazal membran (BM), epitel dokusu morfolojisinin ve organ morfogenezinin kurulması ve sürdürülmesi için kritik öneme sahiptir. Dahası, BM doku modellemesi için gereklidir, bir sinyal platformu görevi görür ve dokuları ve organları şekillendirmek için dış kuvvetler sağlar. BM'nin normal gelişim ve patolojik durumlar sırasında oynadığı birçok önemli role rağmen, BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını kontrol eden biyolojik yollar ve bazal sekresyonun BM proteinlerinin polarize birikimine nasıl yol açtığı tam olarak anlaşılamamıştır. Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli, BM membran proteinlerinin bazal birikimini incelemek için mükemmel bir model sistemidir, çünkü BM'nin tüm ana bileşenlerini üretir ve salgılar. sabit dokularda görüntü işleme ile birleştirilen konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme, özellikle BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığı ve birikiminde rol oynayan hücresel faktörlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Bu makalede, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epitelindeki endojen olarak etiketlenmiş proteinler kullanılarak BM içeren veziküllerin ve biriken BM'nin boyanması ve görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol hem kalitatif hem de nicel soruları ele almak için uygulanabilir ve epitel dokusu gelişimi sırasında polarize hücre içi kaçakçılık ve veziküllerin salgılanmasında rol oynayan faktörlerin hızlı ve verimli bir şekilde tanımlanmasına olanak tanıyan yüksek verimli taramaya uyum sağlamak için geliştirilmiştir.

Burada açıklanan yöntemler, Drosophila yumurtalıklarının FE'si gibi polarize epitel hücrelerinde BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu verimli ve doğru bir şekilde görüntülemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Daha sonra, açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilen beklenen sonuçların yanı sıra yararlı tavsiyeler ve potansiyel tuzaklar sunuyoruz. Bunu yapmak için, endojen olarak etiketlenmiş bir Vkg (Drosophila Col IV) olan Vkg-GFP kullanı...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Bu protokol, Drosophila dizisini model bir sistem olarak kullanarak hücre içi kaçakçılığın ve bazal membran proteinlerinin salgılanmasının karakterizasyonuna izin verir. Tekniğimizin temel avantajı, endojen olarak etiketlenmiş proteinler ve Airyscan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak bazal membran proteinlerinin hücre içi trafiğinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin vermesidir. Bu protokol, bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını görüntülemek için geliştirilmiş olsa da, diğer proteinlerin ve hücre kültürü ve organoidler de dahil olmak üzere diğer biyolojik sistemlerin kaçakçılığını incelemek için genişletilebilir.Başlamak için, PBS'deki Drosophila yumurtalıklarını diseksiyon kapsamı altında diseke ettikten sonra, bir mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve yumurtalıkları 15 dakika boyunca bir somun platformunda sabitleyin. Fiksasyon çözeltisini çıkarın ve her biri bir mililitre PBST içeren iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Mikrosantrifüj tüplerini beş ila altı kez hafifçe ters çevirerek, daha sonra bir somun platformu rocker üzerinde bir mililitre PBST ile her biri 10 dakikalık dört uzun yıkama gerçekleştirin.Fiksasyon ve yıkama yaptıktan sonra, PBST'yi çıkarın, ardından bir mililitre engelleme çözeltisi ekleyin ve yumurtalıkları en az bir saat boyunca bir somun platformu rocker üzerinde bloke edin. Daha sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve bloke edici çözeltide uygun konsantrasyonlarında seyreltilmiş birincil antikorlar içeren 300 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. 4 santigrat derecede bir nutating platform rocker üzerinde gece boyunca inkübe edin.Birincil antikor çözeltisini çıkardıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi iki hızlı yıkama ve dört uzun yıkama gerçekleştirin, ardından PBST'yi çıkarın ve kullanılan birincil antikorları tespit edecek floresan sekonder antikorlar içeren 500 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Yumurtalıkları ikincil antikor çözeltisindeki yumurtalıkları oda sıcaklığında iki saat boyunca bir nutating platform rocker üzerinde inkübe edin, daha sonra bir nutating platform rocker'da daha önce gösterildiği gibi PBST'de iki hızlı yıkama ve dört uzun yıkama gerçekleştirin. Son yıkamadan sonra, yumurta odalarını ayırmak için yumurtalıkları tüp içinde yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetlemek için bir P-1000 pipet kullanın.Tüpü beş ila 10 dakika boyunca dik konumda tutarak yumurta odalarının dibe batmasına izin verin. Ardından, PBST'yi bir Pasteur pipet kullanarak çıkarın ve yaklaşık 50 mikrolitre bırakın. Daha sonra, bir P-200 pipet kullanarak kalan PBST'nin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve bir kapak kayması üzerine eşit şekilde yayılacak kadar iki damla montaj ortamı ekleyin.Viskoz montaj ortamının mikrosantrifüj tüpünden kızağa kolayca aktarılmasını sağlamak için, P-200 pipet ucunun ucunu kesin. Daha sonra, montaj ortamındaki tüm yumurta odalarını yavaşça cam slayta aktarın ve kabarcıklar oluşturmadığınızdan emin olun. Diseksiyon mikroskobu altında, montaj ortamını yavaşça dağıtın ve yumurta odalarını, yaklaşık bir kapak kayması büyüklüğünde bir alanı kaplamak için yeni bir P-200 pipet ucu veya forseps kullanarak ayırın.Forseps kullanarak, kabarcıkları önlemek için kapak kaymasını yumurta odalarına dikkatlice bir açıyla yerleştirin ve slaytı polimerize etmek için iki gün boyunca karanlıkta düz bir yüzeyde oda sıcaklığında saklayın. Montaj ortamı sertleştikten sonra, slayt görüntüleme için birkaç hafta boyunca karanlıkta 4 santigrat derecede saklanabilir. Bodrum zarı proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek için, hedefi 63x'e ayarlayın ve yavaşça lensine bir damla daldırma yağı yerleştirin, ardından kapağı numuneyi bulma hedefine bakacak şekilde slaytı objektif üzerine yerleştirin.Epifloresan mikroskobun göz merceğini kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi bulun, ardından floroforların makalede açıklandığı gibi görüntülenmesi için uygun ayarlara sahip bir konfigürasyon seçin. Yapılandırma ayarlandıktan sonra, Edinme Modu altında Canlı seçeneğini belirleyerek numunenin görüntüsünü alın ve numunenin tarama alanını optimize etmek için yakınlaştırmayı 2 ile 4x arasında ayarlayın. Her bir kanal için, Kanal altında bir parça seçin ve Canlı'yı tıklayın.Aralık göstergesi aracını kullanırken ana kazancı ve lazer gücünü ayarlayın ve makalede açıklandığı gibi doymuş pikselleri önlemek için tüm yönergeleri izleyin ve her kanal için aynısını tekrarlayın. Edinme Modu geçiş penceresinde, Görüntü Boyutu altında, dedektörün yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak ve çerçeve boyutunu otomatik olarak ayarlamak için SR'ye tıklayın. Airyscan modunda ortalamayı Yok olarak tutun, çünkü genellikle gerekli değildir ve tarama süresini kısaltır.Bununla birlikte, bazı durumlarda, ortalama 2x'lik bir değer, sinyal-gürültü oranını artırabilir, ardından bir görüntü elde etmek için Snap'e tıklayın. Bir Z-yığını edinmek için, Edinme sekmesinin altındaki Z-Yığını onay kutusuna tıklayın. Ardından, numuneyi gözlemlemek için istediğiniz kanalı seçin.Örneğin, DAPI kanalı ve canlı bir tarama başlatmak için Canlı'ya tıklayın, ardından mikroskoptaki ince ayar düğmesini kullanarak Z-yığını için bir aralık ayarlayın. Daha sonra, İlk Ayarla ve Son Ayarla'yı tıklatarak Z-yığınının uç noktalarını ayarlayın. En uygun 3B yeniden yapılandırma için, adım boyutunu atamak üzere Z yığınının aralığını 0,5 mikrometreden daha düşük bir değere ayarlayın ve Z-yığını alımına başlamak için Denemeyi Başlat'a tıklayın.Görüntüler veya Z-yığını elde edildikten sonra, İşleme, ardından Yöntem seçeneğine tıklayın ve Airyscan İşleme'yi seçin. Başlamak için Otomatik Filtre uygulayın ve gerekirse, numune için en iyi sonuçları elde etmek üzere süper çözünürlük değerini değiştirerek daha fazla manuel işleme gerçekleştirin. En uygun SR değeri belirlendikten sonra, işlenmiş bir görüntü oluşturmak için Uygula'ya tıklayın.Z-yığını görüntüleri söz konusu olduğunda, 3B İşleme kutusuna tıklayarak bir Z-dilimi veya tüm Z-yığını olarak işleyin. Bir Z-yığınının alınmasından sonra 3B'de protein kaçakçılığını görselleştirmek için, önizleme penceresindeki 3B simgesine tıklayarak Airyscan işlenmiş görüntünün ekran kontrolü bölümünde görünecek bir 3B görüntü oluşturun. Farklı 3B görünüm seçeneklerinden, veziküllerin yapısını görüntülerken Yüzey veya Karışık görünümleri kullanın.En yüksek kaliteli görüntü için, En Hızlı ayarı daha az doğru olacağından ve zayıf 3B işlemeye yol açacağından Hassas ayarını seçin. Görüntü oluşturulduktan sonra, tercih edilen bir konuma odaklanmak için yakınlaştırıp döndürerek 3B görüntüyü değiştirin. Görünüm elde edildikten sonra, 3B sekmesi altında, Görüntülenen Çözünürlük'ü seçin ve ardından görüntünün görüntülendiği yönde bir anlık görüntüsünü oluşturacak ve çeşitli dosya biçimlerinde kaydedilip dışa aktarılabilecek Görüntü Oluştur'a tıklayın.Konfokal mikroskopi, edinme parametreleri optimize edildiğinde Viking-GFP gibi bazal membran proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu ve birikimini görselleştirmek için kullanılabilir. Yakalama ve görüntü işleme düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde, süper çözünürlüklü mikroskopi, konfokal mikroskopiye kıyasla görüntü çözünürlüğünü arttırır. Viking gibi bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığında daha iyi tanımlanmış görüntülerle gösterildiği gibi.Ortogonal projeksiyon, bazal membran proteinleri içeren veziküllerin ve bölmelerin genel dağılımının konfokal veya süper çözünürlüklü görüntüleme kullanılarak tek bir görüntüde görselleştirilmesini sağlar. Hücre içi bazal membran proteinlerinin lokalizasyonunu ve dağılımını değerlendirmek için konfokal veya süper çözünürlüklü görüntüleme ile alınan bir optik Z-kesitleri yığınını bir araya getirerek bir 3D rekonstrüksiyon kullanılmıştır. Süper çözünürlüklü görüntüleme, mutant koşullarda bazal membran proteinlerinin hassas lokalizasyonunu belirlemek için kullanılabilir.Örneğin, Crag knockdown epitel hücrelerinde, bazal membran proteinleri hem apikal hem de bazal olarak birikir, bu da bazal membran proteinlerinin polarize sekresyonunu kontrol ettiğini gösterir. Konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi, ko-lokalizasyon deneylerinde de kullanılabilir. Örneğin, bu şekil Viking-GFP'nin kısmi birlikte lokalizasyonunu ve bir Golgi işaretleyicisi GM-130'u göstermekte ve Viking'in salgılanmadan önce Golgi'ye sıralandığını doğrulamaktadır.Süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak bazal membran proteinlerinin kaçakçılığını verimli bir şekilde görüntülemek için, yumurtalıkları dikkatlice monte etmenizi ve edinim ve evrişim parametrelerini ayarlarken özellikle dikkat etmenizi öneririz. Bu protokol, bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen diğer proteinlerin kaçakçılığını verimli bir şekilde görüntülemek için kolayca değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Gelişim Biyolojisi

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...