该技术提供了一种实用的方法，可以通过流式细胞术估计多种人类精子功能生物标志物，而不会因等待时间过长而导致实验质量的实质性影响。该技术可以成为诊断不孕症和评估精子功能的实用可靠的工具包，并补充常规精子检查。此过程在 Accuri C6 平台上执行，只需稍作修改即可应用于其他商业平台。
首先，将精液样品在 37 摄氏度下孵育，并将样品完全液化一小时。要对精子细胞进行计数，请将液化精液样品彻底混合，然后将10微升精液加入精子计数室中，并在精子类分析仪中扫描载玻片。计算至少六个区域和 400 个精子以估计精子浓度。
为了检测精子凋亡，使用膜联蛋白-5 FITC PI染色，将10个精子细胞添加到1.5毫升离心管中。用 500 微升冷 PBS 洗涤细胞。然后，离心精子细胞悬液并弃去上清液，然后将细胞重悬于200微升结合缓冲液中。
接下来，加入 2 微升 FITC 膜联蛋白-5 和 2 微升 PI。轻轻涡旋细胞并在室温下在黑暗中孵育 15 分钟，然后将它们放入流式细胞仪中进行分析。为了使用JC-1探针分析线粒体膜电位或MMP，将第六个精子细胞加入1.5毫升管中并离心。离心后，将精子细胞悬浮液重新悬浮在一毫升JC-1工作溶液中。
轻轻涡旋细胞，在37摄氏度的黑暗中孵育20分钟。再次，离心悬浮液，弃去上清液，用一毫升PBS洗涤沉淀两次。然后，将染色的精子细胞重悬于流式细胞仪管中的一毫升PBS中，并立即将管放入流式细胞仪中进行分析。
接下来，使用羰基氰间氯苯腙或CCCP作为阳性对照。将精子细胞重悬于一毫升CCCP工作溶液中，轻轻涡旋，然后在室温下孵育20分钟。孵育后，离心悬浮液，弃去上清液，并执行使用JC-1探针分析MMP的步骤，如图所示。
对于精子染色质结构测定（SCSA），在37摄氏度的水浴下解冻精液样品，并用TNE缓冲液稀释至每毫升10至第六个细胞的1至2倍浓度。接下来，将 200 微升稀释的样品加入流式细胞仪试管中，并将其与 400 微升酸溶液混合。用 1.2 毫升吖啶橙溶液染色样品。
使用参考样品作为流式细胞仪设置和校准的内标。用 4 摄氏度 TNE 缓冲液将样品稀释至每毫升 10 至 6 个细胞的 1 至 2 倍浓度，并执行 SCSA 的步骤，如图所示。打开流式细胞仪软件并启动流式细胞仪。
要收集样品数据，请将对照样品加载到流式细胞仪上，然后单击“运行”开始数据收集。创建用于查看数据的点图。选择 XY 轴参数并显示线性以指定数据。
然后，选择并应用多边形门来描绘精子群体以进行分析。对于精子凋亡，将 FL1 设置为 X 轴，将 FL2 设置为 Y 轴。然后，要分离活的凋亡或坏死细胞，点击并拖动象限门，将精子群细分为四个特定群。
对于 MMP，将 FL1 设置为 X 轴，将 FL2 设置为 Y 轴。然后，创建一个多边形门，将精子群体细分为两个特定的群体。对于 SCSA，将 FL4 设置为 X 轴，将 FL1 设置为 Y 轴。
绘制门，设置45度角以排除蜂窝碎片信号。计算每个样本的 10， 000 个精子细胞，用于精子凋亡、MMP 和 SCSA 分析，设置运行限值以指示何时停止收集数据、流化速率，具体取决于细胞数量和阈值以消除碎片和噪音。将这些设置应用于所有示例。
如有必要，设置颜色补偿以校正荧光溢出。轻轻地将样品移回，然后再将其加载到流式细胞仪上。然后，输入示例名称并单击“运行”。
运行完成后，通过提供文件名将示例数据另存为 FCS 文件，以便进一步分析。此处显示了使用膜联蛋白-5 FITC PI染色测量精子凋亡。该分析包括对未染色精子细胞的阴性对照，以设置补偿和象限。
在精子凋亡的样本中，结果表示为活细胞或活细胞的百分比：早期凋亡或凋亡，晚期凋亡和坏死细胞。这里显示了具有高和低MMP的精子亚群。优质精液样本呈高橙色和低绿色荧光。
相反，质量较差的精液样本表现出低橙色和高绿色荧光。此处显示了来自有生育能力和不育男性的 SCSA 细胞图。精子细胞群被鉴定为正常，具有高 DNA 稳定性、DNA 片段化指数和细胞碎片。
精液样本必须在 37 摄氏度下孵育并完全液化长达一小时。
