Denne teknik præsenterer en praktisk tilgang til at estimere flere humane spermatozoer funktionelle biomarkører ved flowcytometri uden væsentligt kompromis med eksperimentkvaliteten induceret af langvarige ventetider. Denne teknik kan være et praktisk og pålideligt værktøjssæt til diagnosticering af infertilitet og evaluering af sædfunktion på både bænk og seng og supplere den rutinemæssige sædundersøgelse. Denne procedure udføres med Accuri C6-platformen, og den kan anvendes på andre kommercielle platforme med mindre ændringer.
Til at begynde med inkuberes sædprøven ved 37 grader Celsius og flyder prøven fuldstændigt i en time. For at tælle sædcellerne blandes den flydende sædprøve grundigt, tilsættes derefter 10 mikroliter sæd i et sædtællingskammer og scanner diaset i en sædklasseanalysator. Tæl mindst seks områder og 400 spermatozoer for at estimere sædkoncentrationen.
Til påvisning af sædapoptose ved hjælp af annexin-5 FITC PI-farvning tilsættes 10 til de sjette sædceller til et 1,5 ml centrifugerør. Vask cellerne med 500 mikroliter kold PBS. Derefter centrifugeres sædcellesuspensionen, og supernatanten kasseres, inden cellerne genopslæmmes i 200 mikroliter bindingsbuffer.
Derefter tilsættes to mikroliter FITC annexin-5 og to mikroliter PI. Forsigtigt hvirvel cellerne og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur i mørket, før de placeres i flowcytometeret til analyse. Til analyse af mitokondriemembranpotentiale eller MMP ved hjælp af JC-1-sonde tilsættes to gange 10 til de sjette sædceller til et 1,5 ml rør og centrifuge. Efter centrifugering resuspenderes sædcellesuspensionen i en milliliter JC-1 arbejdsløsning.
Forsigtigt hvirvel cellerne og inkuber i 20 minutter ved 37 grader Celsius i mørket. Suspensionen centrifugeres igen, supernatanten kasseres, og pelletnen vaskes to gange med en milliliter PBS. Derefter suspenderes de farvede sædceller igen i en milliliter PBS i et flowcytometerrør, og straks placeres røret i flowcytometeret til analyse.
Brug derefter carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon eller CCCP som en positiv kontrol. Re-suspendere sædcellerne i en milliliter CCCP arbejdsløsning og forsigtigt hvirvel, før inkubation ved stuetemperatur i 20 minutter. Efter inkubation centrifugeres suspensionen, supernatanten kasseres, og der udføres trin til analyse af MMP ved hjælp af JC-1-sonden som vist.
Til sædkromatinstrukturanalyse eller SCSA optø sædprøven ved et 37 grader Celsius vandbad og fortyndes med TNE-buffer til en koncentration på en til to gange 10 til de sjette celler pr. Milliliter. Derefter tilsættes 200 mikroliter af den fortyndede prøve til et flowcytometer reagensglas og blandes med 400 mikroliter syreopløsning. Plet prøven med 1,2 ml acridin-orange opløsning.
Brug en referenceprøve som intern standard til flowcytometeropsætning og kalibreringer. Fortynd prøven med fire grader Celsius TNE-buffer til en koncentration på en til to gange 10 til de sjette celler pr. milliliter, og udfør trinene for SCSA som vist. Åbn flowcytometersoftwaren, og start cytometeret.
Hvis du vil indsamle eksempeldata, skal du indlæse en kontrolprøve på flowcytometeret og klikke på Kør for at starte dataindsamlingen. Opret prikplots til visning af data. Vælg XY-akseparametrene, og vis lineær for at angive data.
Vælg og anvend derefter en polygonal port for at afgrænse sædpopulationen til analyse. For sædapoptose skal du indstille FL1 som X-aksen og FL2 som Y-aksen. For at isolere de levende apoptotiske eller nekrotiske celler skal du trykke og trække kvadrantporten for at underindstille sædpopulationerne ned til fire specifikke populationer.
For MMP skal du indstille FL1 som X-aksen og FL2 som Y-aksen. Opret derefter en polygonal port for at undersætte sædpopulationerne ned til to specifikke populationer. For SCSA skal du indstille FL4 som X-aksen og FL1 som Y-aksen.
Tegn porten, indstil en 45 graders vinkel for at udelukke cellulære affaldssignaler. Beregn 10.000 sædceller for hver prøve til sædapoptose, MMP og SCSA-analyser, indstil en kørselsgrænse for at angive, hvornår man skal stoppe med at indsamle data, fluidikhastighed, afhængigt af cellenumre og tærskel for at fjerne snavs og støj. Anvend disse indstillinger for alle eksempler.
Indstil om nødvendigt farvekompensationen for at korrigere fluorescerende spild. Prøven pipetteres forsigtigt tilbage, før den lægges på flowcytometeret. Indtast derefter eksempelnavnet, og klik på Kør.
Når kørslen er fuldført, skal du gemme eksempeldataene som FCS-fil ved at give et filnavn til yderligere analyse. Måling af sædapoptose ved hjælp af annexin-five FITC PI-farvning er vist her. Denne analyse omfattede negativ kontrol af ufarvede sædceller for at indstille kompensation og kvadranter.
I en prøve med sædapoptose blev resultaterne udtrykt som procentdele af levedygtige eller levende tidlige apoptotiske eller apoptotiske, sene apoptotiske og nekrotiske celler. Sædsubpopulationen med høj og lav MMP er vist her. En sædprøve af god kvalitet viste høj orange og lav grøn fluorescens.
Omvendt viste en sædprøve af dårlig kvalitet lav orange og høj grøn fluorescens. SCSA-cytogrammerne fra en frugtbar og infertile mand er vist her. Sædcellepopulationen blev identificeret som normal med høj DNA-stabilitet, DNA-fragmenteringsindeks og celleaffald.
Sædprøven skal inkuberes ved 37 grader Celsius og gøres fuldstændig flydende i op til en time.
