यह तकनीक लंबे समय तक प्रतीक्षा समय से प्रेरित प्रयोग की गुणवत्ता के पर्याप्त समझौते के बिना फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कई मानव शुक्राणु कार्यात्मक बायोमाकर्स का अनुमान लगाने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है। यह तकनीक बांझपन के निदान और बेंच और बिस्तर दोनों पर शुक्राणु समारोह के मूल्यांकन के लिए एक व्यावहारिक और विश्वसनीय टूलकिट हो सकती है, और नियमित शुक्राणु परीक्षा के पूरक हो सकती है। यह प्रक्रिया Accuri C6 प्लेटफ़ॉर्म के साथ की जाती है और इसे मामूली संशोधनों के साथ अन्य वाणिज्यिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है।
शुरू करने के लिए, वीर्य के नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेने और एक घंटे के लिए नमूने को पूरी तरह से द्रवित करें। शुक्राणु कोशिकाओं की गणना करने के लिए, द्रवित वीर्य के नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं, फिर शुक्राणु गिनती कक्ष में 10 माइक्रोलीटर वीर्य जोड़ें और शुक्राणु वर्ग विश्लेषक में स्लाइड को स्कैन करें। शुक्राणु एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए कम से कम छह क्षेत्रों और 400 शुक्राणुओं की गणना करें।
शुक्राणु एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए, एनेक्सिन -5 एफआईटीसी पीआई धुंधला का उपयोग करके, 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छठे शुक्राणु कोशिकाओं में 10 जोड़ें। 500 माइक्रोलीटर ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। फिर, शुक्राणु कोशिका निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और 200 माइक्रोलीटर बाइंडिंग बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने से पहले सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
इसके बाद, एफआईटीसी एनेक्सिन -5 के दो माइक्रोलीटर और पीआई के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को धीरे से भंवर करें और विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमीटर में रखने से पहले अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, या एमएमपी के विश्लेषण के लिए, जेसी -1 जांच का उपयोग करके, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में छठे शुक्राणु कोशिकाओं में दो गुना 10 जोड़ें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक मिलीलीटर जेसी -1 कामकाजी समाधान में शुक्राणु कोशिका निलंबन को फिर से निलंबित करें।
धीरे से कोशिकाओं को भंवर करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और एक मिलीलीटर पीबीएस के साथ गोली को दो बार धो लें। फिर, एक प्रवाह साइटोमीटर ट्यूब में पीबीएस के एक मिलीलीटर में रंगे हुए शुक्राणु कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और तुरंत विश्लेषण के लिए ट्यूब को प्रवाह साइटोमीटर में रखें।
इसके बाद, कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफेनिलहाइड्राज़ोन, या सीसीसीपी का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में करें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रवेश करने से पहले सीसीसीपी वर्किंग सॉल्यूशन के एक मिलीलीटर में शुक्राणु कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और धीरे से भंवर करें। इनक्यूबेशन के बाद, निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और जेसी -1 जांच का उपयोग करके एमएमपी का विश्लेषण करने के चरणों का पालन करें।
शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख, या एससीएसए के लिए, वीर्य के नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर पिघलाएं और टीएनई बफर के साथ एक से दो गुना 10 से छठी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता तक पतला करें। इसके बाद, एक प्रवाह साइटोमीटर टेस्ट ट्यूब में पतला नमूना के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 400 माइक्रोलीटर एसिड समाधान के साथ मिलाएं। 1.2 मिलीलीटर एक्रिडीन नारंगी घोल के साथ नमूने को दाग दें।
साइटोमीटर सेटअप और अंशांकन प्रवाह के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में एक संदर्भ नमूने का उपयोग करें। चार डिग्री सेल्सियस टीएनई बफर के साथ नमूने को प्रति मिलीलीटर 10 से छठी कोशिकाओं तक एक से दो गुना की एकाग्रता तक पतला करें, और एससीएसए के लिए चरणों का प्रदर्शन करें, जैसा कि दिखाया गया है। फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर खोलें और साइटोमीटर शुरू करें।
नमूना डेटा एकत्र करने के लिए, प्रवाह साइटोमीटर पर एक नियंत्रण नमूना लोड करें और डेटा संग्रह प्रारंभ करने के लिए चलाएँ क्लिक करें. डेटा देखने के लिए डॉट प्लॉट बनाएँ. XY अक्ष पैरामीटर का चयन करें और डेटा निर्दिष्ट करने के लिए रैखिक प्रदर्शित करें।
फिर, विश्लेषण के लिए शुक्राणु आबादी को चित्रित करने के लिए एक बहुभुज द्वार का चयन करें और लागू करें। शुक्राणु एपोप्टोसिस के लिए, एफएल 1 को एक्स अक्ष के रूप में और एफएल 2 को वाई अक्ष के रूप में सेट करें। फिर, जीवित एपोप्टोटिक या नेक्रोटिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए, शुक्राणु आबादी को चार विशिष्ट आबादी तक उप-समूह करने के लिए क्वाड्रंट गेट को टैप और खींचें।
एमएमपी के लिए, एफएल 1 को एक्स अक्ष के रूप में और एफएल 2 को वाई अक्ष के रूप में सेट करें। फिर, शुक्राणु आबादी को दो विशिष्ट आबादी तक उप-समूह करने के लिए एक बहुभुज द्वार बनाएं। एससीएसए के लिए, एफएल 4 को एक्स अक्ष के रूप में और एफएल 1 को वाई अक्ष के रूप में सेट करें।
गेट खींचें, सेलुलर मलबे संकेतों को बाहर करने के लिए 45 डिग्री कोण सेट करें। शुक्राणु एपोप्टोसिस, एमएमपी और एससीएसए विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने के लिए 10,000 शुक्राणु कोशिकाओं की गणना करें, मलबे और शोर को खत्म करने के लिए सेल संख्या और दहलीज के आधार पर डेटा, तरल पदार्थ दर एकत्र करना बंद करने के लिए एक रन सीमा निर्धारित करें। सभी नमूने के लिए ये सेटिंग्स लागू करें।
यदि आवश्यक हो, तो फ्लोरोसेंट स्पिलओवर को सही करने के लिए रंग मुआवजा सेट करें। प्रवाह साइटोमीटर पर लोड करने से पहले नमूने को धीरे से वापस पिपेट करें। उसके बाद, नमूना नाम दर्ज करें और चलाएँक्लिक करें।
एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, आगे के विश्लेषण के लिए फ़ाइल नाम देकर नमूना डेटा को एफसीएस फ़ाइल के रूप में सहेजें। एनेक्सिन -पांच एफआईटीसी पीआई धुंधला का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस का माप यहां दिखाया गया है। इस विश्लेषण में मुआवजा और क्वाड्रंट सेट करने के लिए बिना दाग वाले शुक्राणु कोशिकाओं का नकारात्मक नियंत्रण शामिल था।
शुक्राणु एपोप्टोसिस के साथ एक नमूने में, परिणामों को व्यवहार्य या जीवित प्रारंभिक एपोप्टोटिक या एपोप्टोटिक, देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। उच्च और निम्न एमएमपी के साथ शुक्राणु उप-जनसंख्या यहां दिखाई गई है। एक अच्छी गुणवत्ता वाले वीर्य के नमूने ने उच्च नारंगी और कम हरे रंग की प्रतिदीप्ति दिखाई।
इसके विपरीत, एक खराब गुणवत्ता वाले वीर्य के नमूने ने कम नारंगी और उच्च हरे रंग की प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया। एक उपजाऊ और आदमी से एससीएसए साइटोग्राम यहां दिखाए गए हैं। शुक्राणु कोशिका की आबादी को उच्च डीएनए स्थिरता, डीएनए विखंडन सूचकांक और सेल मलबे के साथ सामान्य के रूप में पहचाना गया था।
वीर्य के नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए और एक घंटे तक पूरी तरह से तरलीकृत किया जाना चाहिए।
