이 기술은 긴 대기 시간으로 인한 실험 품질의 실질적인 저하 없이 유세포 분석을 통해 여러 인간 정자 기능적 바이오마커를 추정할 수 있는 실용적인 접근 방식을 제시합니다. 이 기술은 벤치와 침대 모두에서 불임 진단 및 정자 기능 평가를 위한 실용적이고 신뢰할 수 있는 툴킷이 될 수 있으며 일상적인 정자 검사를 보완할 수 있습니다. 이 절차는 Accuri C6 플랫폼에서 수행되며 약간의 수정을 통해 다른 상용 플랫폼에 적용 할 수 있습니다.
먼저 섭씨 37도에서 정액 샘플을 배양하고 1시간 동안 샘플을 완전히 액화시킵니다. 정자 세포를 계산하려면 액화 정액 샘플을 완전히 혼합한 다음 정자 계수 챔버에 정액 10마이크로리터를 넣고 정자 등급 분석기에서 슬라이드를 스캔합니다. 정자 농도를 추정하기 위해 최소 6개의 영역과 400개의 정자를 계산합니다.
정자 세포사멸을 검출하기 위해 annexin-5 FITC PI 염색을 사용하여 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 6번째 정자 세포에 10개를 추가합니다. 500 마이크로 리터의 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오. 그런 다음, 정자 세포 현탁액을 원심분리하고 200 마이크로리터의 결합 완충액에 세포를 다시 현탁시키기 전에 상층액을 버립니다.
다음으로, 2 마이크로 리터의 FITC annexin-5와 2 마이크로 리터의 PI를 추가합니다. 세포를 부드럽게 소용돌이치고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양한 후 분석을 위해 유세포 분석기에 넣습니다. JC-1 프로브를 사용하여 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 분석하려면 1.5밀리리터 튜브와 원심분리기에 여섯 번째 정자 세포에 10을 두 번 추가합니다. 원심분리 후에, 1 밀리리터 JC-1 작동 해결책에 있는 정세포 현탁액을 다시 현탁시키십시오.
세포를 부드럽게 소용돌이치고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 다시 현탁액을 원심 분리하고 상층액을 버리고 PBS 1 밀리리터로 펠릿을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 염색된 정자 세포를 유세포 분석기 튜브에 1mL PBS에 다시 현탁시키고 분석을 위해 즉시 튜브를 유세포 분석기에 넣습니다.
다음으로, 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐히드라존(Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone, CCCP)을 양성 대조군으로 사용합니다. CCCP 작업 용액 1밀리리터에 정자 세포를 다시 현탁시키고 실온에서 20분 동안 배양하기 전에 부드럽게 소용돌이칩니다. 배양 후 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 버리고, 시연된 대로 JC-1 프로브를 사용하여 MMP를 분석하는 단계를 수행합니다.
정자 염색질 구조 분석(SCSA)의 경우 정액 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 해동하고 TNE 완충액으로 밀리리터당 1-2배 10-6번째 세포의 농도로 희석합니다. 다음으로, 희석된 샘플 200마이크로리터를 유세포 분석기 시험관에 넣고 400마이크로리터의 산성 용액과 혼합합니다. 샘플을 1.2ml의 아크리딘 오렌지 용액으로 염색합니다.
참조 검체를 내부 표준물질로 사용하여 유세포분석기 설정 및 보정을 수행할 수 있습니다. 샘플을 섭씨 4도의 TNE 버퍼로 1-2배의 농도로 희석하여 밀리리터당 10-6번째 셀의 농도로 희석하고 시연된 대로 SCSA에 대한 단계를 수행합니다. 유세포 분석기 소프트웨어를 열고 유세포 분석기를 시작합니다.
샘플 데이터를 수집하려면 대조군 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 Run(실행)을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 데이터를 보기 위한 점도표를 만듭니다. XY축 매개변수를 선택하고 선형을 표시하여 데이터를 지정합니다.
그런 다음 다각형 게이트를 선택하고 적용하여 분석을 위한 정자 모집단을 묘사합니다. 정자 세포 사멸의 경우 FL1을 X축으로, FL2를 Y축으로 설정합니다. 그런 다음 살아있는 자가사멸 또는 괴사 세포를 분리하려면 사분면 게이트를 탭하고 드래그하여 정자 집단을 4개의 특정 집단으로 하위 집합합니다.
MMP의 경우 FL1을 X축으로, FL2를 Y축으로 설정합니다. 그런 다음, 정자 집단을 두 개의 특정 집단으로 하위 집합으로 만드는 다각형 게이트를 만듭니다. SCSA의 경우 FL4를 X축으로, FL1을 Y축으로 설정합니다.
게이트를 그리고 셀룰러 파편 신호를 제외하기 위해 45도 각도를 설정합니다. 정액 세포 사멸, MMP 및 SCSA 분석을 위한 각 샘플에 대해 10, 000개의 정세포를 계산하고, 파편과 소음을 제거하기 위해 세포 수 및 문턱에 따라 데이터 수집을 중지할 때, 유체 속도를 나타내기 위해 실행 한계를 설정합니다. 모든 샘플에 이 설정을 적용합니다.
필요한 경우 형광 번짐을 수정하도록 색상 보정을 설정합니다. 샘플을 유세포 분석기에 로드하기 전에 샘플을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 샘플 이름을 입력하고 실행을 클릭합니다.
실행이 완료되면 추가 분석을 위해 파일 이름을 지정하여 샘플 데이터를 FCS 파일로 저장합니다. annexin-five FITC PI 염색을 사용한 정자 세포 사멸 측정이 여기에 나와 있습니다. 이 분석에는 보정 및 사분면을 설정하기 위해 염색되지 않은 정자 세포의 음성 대조가 포함되었습니다.
정자 자가사멸이 있는 샘플에서 결과는 생존 가능하거나 살아있는 초기 자가사멸 또는 자가사멸, 후기 자가사멸 및 괴사 세포의 비율로 표현되었습니다. MMP가 높거나 낮은 정자 하위 집단이 여기에 나와 있습니다. 좋은 품질의 정액 샘플은 높은 주황색과 낮은 녹색 형광을 보여주었습니다.
반대로, 품질이 좋지 않은 정액 샘플은 낮은 주황색과 높은 녹색 형광을 보여주었습니다. 가임 및 불임 남성의 SCSA 사이토그램이 여기에 나와 있습니다. 정자 세포 집단은 높은 DNA 안정성, DNA 단편화 지수 및 세포 파편으로 정상으로 확인되었습니다.
정액 샘플은 섭씨 37도에서 배양하고 최대 1시간 동안 완전히 액화해야 합니다.
