Denne teknikken presenterer en praktisk tilnærming for å estimere flere humane spermatozoer funksjonelle biomarkører ved flowcytometri uten vesentlig kompromiss av eksperimentkvaliteten indusert av langvarige ventetider. Denne teknikken kan være en praktisk og pålitelig verktøykasse for diagnostisering av infertilitet og evaluering av sædfunksjon på både benk og seng, og utfylle den rutinemessige sædundersøkelsen. Denne prosedyren utføres med Accuri C6-plattformen, og den kan brukes på andre kommersielle plattformer med mindre modifikasjoner.
For å begynne, inkuber sædprøven ved 37 grader Celsius og fortynn prøven helt i en time. For å telle sædcellene, bland den flytende sædprøven grundig, tilsett deretter 10 mikroliter sæd i et sædtellingskammer og skann lysbildet i en sædklasseanalysator. Telle minst seks områder og 400 spermatozoer for å estimere sædkonsentrasjonen.
For påvisning av spermapoptose, ved bruk av vedlegg-5 FITC PI-farging, tilsett 10 til de sjette sædcellene til et 1,5 milliliter sentrifugerør. Vask cellene med 500 mikroliter kald PBS. Deretter sentrifugerer du sædcellesuspensjonen og kaster supernatanten før du suspenderer cellene i 200 mikroliter bindingsbuffer.
Deretter tilsettes to mikroliter FITC annexin-5 og to mikroliter PI. Virvle cellene forsiktig og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørket før du plasserer dem i strømningscytometeret for analyse. For analyse av mitokondriemembranpotensial, eller MMP, ved bruk av JC-1-sonde, tilsett to ganger 10 til de sjette sædcellene til et 1, 5 milliliter rør og sentrifuge. Etter sentrifugering, re-suspendere sperm celle suspensjon i en milliliter JC-1 arbeidsløsning.
Virvle cellene forsiktig og rug i 20 minutter ved 37 grader Celsius i mørket. Sentrifuger suspensjonen, kast supernatanten og vask pelleten to ganger med en milliliter PBS. Deretter suspenderer du de fargede sædcellene i en milliliter PBS i et flowcytometerrør, og plasserer umiddelbart røret i strømningscytometeret for analyse.
Deretter bruker du karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon, eller CCCP som en positiv kontroll. Resuspender sædcellene i en milliliter CCCP arbeidsløsning og forsiktig virvel før inkubering ved romtemperatur i 20 minutter. Etter inkubering, sentrifuger suspensjonen, kast supernatanten og utfør trinnene for å analysere MMP ved hjelp av JC-1-sonden som demonstrert.
For sædkromatinstrukturanalyse, eller SCSA, tine sædprøven ved et 37 graders Celsius vannbad og fortynn med TNE Buffer til en konsentrasjon på en til to ganger 10 til den sjette cellen per milliliter. Deretter tilsettes 200 mikroliter av den fortynnede prøven til et strømningscytometerreagensrør og blandes med 400 mikroliter syreoppløsning. Flekk prøven med 1,2 ml akridin oransje løsning.
Bruk en referanseprøve som en intern standard for oppsett og kalibrering av flowcytometer. Fortynn prøven med fire grader Celsius TNE Buffer til en konsentrasjon på en til to ganger 10 til den sjette cellen per milliliter, og utfør trinnene for SCSA, som demonstrert. Åpne flowcytometer-programvaren og start cytometeret.
Hvis du vil samle inn eksempeldata, laster du inn en kontrollprøve på flowcytometeret og klikker Kjør for å starte datainnsamlingen. Opprett punktdiagrammer for visning av data. Velg XY-akseparametrene og vis lineær for å spesifisere data.
Velg deretter og bruk en polygonal port for å avgrense sædpopulasjonen for analyse. For spermapoptose, sett FL1 som X-aksen og FL2 som Y-aksen. Deretter, for å isolere de levende apoptotiske eller nekrotiske cellene, trykk og dra kvadrantporten for å sette sædpopulasjonene ned til fire spesifikke populasjoner.
For MMP angir du FL1 som X-aksen og FL2 som Y-aksen. Deretter oppretter du en polygonal port for å underordne sædpopulasjonene ned til to spesifikke populasjoner. For SCSA angir du FL4 som X-aksen og FL1 som Y-aksen.
Tegn porten, sett en 45-graders vinkel for å utelukke cellulære rusksignaler. Beregn 10.000 sædceller for hver prøve for sædapoptose-, MMP- og SCSA-analyser, sett en løpsgrense for å indikere når du skal slutte å samle inn data, fluidikkhastighet, avhengig av cellenummer og terskel for å eliminere rusk og støy. Bruk disse innstillingene for alle eksempler.
Still om nødvendig inn fargekompensasjonen for å korrigere fluorescerende spillover. Pipetter prøven forsiktig tilbake før den legges på flowcytometeret. Skriv deretter inn eksempelnavnet og klikk Kjør.
Når kjøringen er fullført, lagrer du eksempeldataene som FCS-fil ved å angi et filnavn for videre analyse. Måling av spermapoptose ved bruk av annexin-fem FITC PI farging er vist her. Denne analysen inkluderte negativ kontroll av ufargede sædceller for å sette kompensasjon og kvadranter.
I en prøve med spermapoptose ble resultatene uttrykt som prosentandelen av levedyktige eller levende tidlige apoptotiske eller apoptotiske, sene apoptotiske og nekrotiske celler. Spermiepopulasjonen med høy og lav MMP er vist her. En sædprøve av god kvalitet viste høy oransje og lav grønn fluorescens.
Omvendt viste en sædprøve av dårlig kvalitet lav oransje og høy grønn fluorescens. SCSA-cytogrammene fra en fruktbar og ufruktbar mann er vist her. Sædcellepopulasjonen ble identifisert som normal med høy DNA-stabilitet, DNA-fragmenteringsindeks og celleavfall.
Sædprøven må inkuberes ved 37 grader Celsius og fullstendig flytende i opptil en time.