Esta técnica apresenta uma abordagem prática para estimar múltiplos biomarcadores funcionais de espermatozoides humanos por citometria de fluxo sem comprometer substancialmente a qualidade do experimento induzida por tempos de espera prolongados. Essa técnica pode ser uma ferramenta prática e confiável para o diagnóstico de infertilidade e avaliação da função espermática tanto na bancada quanto na cama, além de complementar o exame de rotina dos espermatozoides. Este procedimento é realizado com a plataforma Accuri C6 e pode ser aplicado a outras plataformas comerciais com pequenas modificações.
Para começar, incube a amostra de sêmen a 37 graus Celsius e liquefaça completamente a amostra por uma hora. Para contar os espermatozoides, misture a amostra de sêmen liquefeito completamente, adicione 10 microlitros de sêmen em uma câmara de contagem de espermatozoides e digitalize a lâmina em um analisador de classe de espermatozoides. Conte pelo menos seis áreas e 400 espermatozoides para estimar a concentração espermática.
Para detecção de apoptose espermática, usando a coloração FITC PI de anexina-5, adicione 10 ao sexto espermatozoides a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave as células com 500 microlitros de PBS frio. Em seguida, centrifugar a suspensão de espermatozoides e descartar o sobrenadante antes de ressuspender as células em 200 microlitros de tampão de ligação.
Em seguida, adicione dois microlitros de FITC anexina-5 e dois microlitros de PI. Vórtice suavemente as células e incube por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro antes de colocá-las no citômetro de fluxo para análise. Para análise do potencial de membrana mitocondrial, ou MMP, usando a sonda JC-1, adicione duas vezes 10 ao sexto espermatozoide a um tubo de 1,5 mililitro e centrífuga. Após a centrifugação, ressuspenda a suspensão de espermatozoides em uma solução de trabalho JC-1 de um mililitro.
Vórtice suavemente as células e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Novamente, centrifugar a suspensão, descartar o sobrenadante e lavar o pellet duas vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, ressuspenda os espermatozoides tingidos em um mililitro de PBS em um tubo de citômetro de fluxo e coloque imediatamente o tubo no citômetro de fluxo para análise.
Em seguida, use cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona, ou CCCP como um controle positivo. Ressuspenda os espermatozoides em um mililitro de solução de trabalho CCCP e vomite suavemente antes de incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação, centrifugar a suspensão, descartar o sobrenadante e executar as etapas de análise da MMP usando a sonda JC-1, conforme demonstrado.
Para o ensaio de estrutura da cromatina espermática, ou SCSA, descongelar a amostra de sêmen em banho-maria de 37 graus Celsius e diluir com tampão TNE para uma concentração de uma a duas vezes 10 para a sexta célula por mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros da amostra diluída a um tubo de ensaio de citômetro de fluxo e misture com 400 microlitros de solução ácida. Manchar a amostra com 1,2 mililitros de solução de laranja de acridina.
Use uma amostra de referência como padrão interno para a configuração e calibragem do citômetro de fluxo. Diluir a amostra com quatro graus Celsius TNE Buffer para uma concentração de uma a duas vezes 10 a sexta células por mililitro, e executar os passos para SCSA, conforme demonstrado. Abra o software do citômetro de fluxo e inicie o citômetro.
Para coletar dados de amostra, carregue uma amostra de controle no citômetro de fluxo e clique em Executar para iniciar a coleta de dados. Crie gráficos de pontos para exibir dados. Selecione os parâmetros do eixo XY e exiba linear para especificar dados.
Em seguida, selecione e aplique uma porta poligonal para delinear a população de espermatozoides para análise. Para apoptose espermática, defina FL1 como eixo X e FL2 como eixo Y. Em seguida, para isolar as células apoptóticas ou necróticas vivas, toque e arraste a porta do quadrante para subdefinir as populações de espermatozoides para quatro populações específicas.
Para MMP, defina FL1 como o eixo X e FL2 como o eixo Y. Em seguida, crie uma porta poligonal para subdefinir as populações de espermatozoides em duas populações específicas. Para SCSA, defina o FL4 como o eixo X e FL1 como o eixo Y.
Desenhe o portão, defina um ângulo de 45 graus para excluir sinais de detritos celulares. Calcular 10.000 espermatozoides para cada amostra para apoptose espermática, análises de MMP e SCSA, definir um limite de execução para indicar quando parar de coletar dados, taxa fluídica, dependendo do número de células e limiar para eliminar detritos e ruído. Aplique essas configurações a todos os exemplos.
Se necessário, defina a compensação de cor para corrigir o transbordamento fluorescente. Volte suavemente a pipetar a amostra antes de carregá-la no citômetro de fluxo. Em seguida, digite o nome do exemplo e clique em Executar.
Quando a execução estiver concluída, salve os dados de exemplo como arquivo FCS fornecendo um nome de arquivo para análise adicional. A medida da apoptose espermática usando a coloração FITC PI de anexina-cinco é mostrada aqui. Esta análise incluiu controle negativo de espermatozoides não corados para definir compensação e quadrantes.
Em uma amostra com apoptose espermática, os resultados foram expressos como as porcentagens de células apoptóticas ou apoptóticas precoces viáveis ou vivas, apoptóticas tardias e necróticas. A subpopulação espermática com alta e baixa MMP é mostrada aqui. Uma amostra de sêmen de boa qualidade apresentou alta fluorescência laranja e baixa fluorescência verde.
Por outro lado, uma amostra de sêmen de baixa qualidade demonstrou baixa fluorescência laranja e alta fluorescência verde. Os citogramas SCSA de um homem fértil e infértil são mostrados aqui. A população de espermatozoides foi identificada como normal, com alta estabilidade do DNA, índice de fragmentação do DNA e debris celulares.
A amostra de sémen deve ser incubada a 37 graus Celsius e completamente liquefeita até uma hora.
