Esta técnica presenta un enfoque práctico para estimar múltiples biomarcadores funcionales de espermatozoides humanos mediante citometría de flujo sin comprometer sustancialmente la calidad del experimento inducida por tiempos de espera prolongados. Esta técnica puede ser una herramienta práctica y fiable para el diagnóstico de la infertilidad y la evaluación de la función de los espermatozoides tanto en el laboratorio como en la cama, y complementar el examen rutinario de los espermatozoides. Este procedimiento se lleva a cabo con la plataforma Accuri C6 y podría aplicarse a otras plataformas comerciales con pequeñas modificaciones.
Para empezar, incubar la muestra de semen a 37 grados centígrados y licuar completamente la muestra durante una hora. Para contar los espermatozoides, mezcle bien la muestra de semen licuado, luego agregue 10 microlitros de semen en una cámara de recuento de espermatozoides y escanee el portaobjetos en un analizador de clase de espermatozoides. Cuente al menos seis áreas y 400 espermatozoides para estimar la concentración de espermatozoides.
Para la detección de la apoptosis de los espermatozoides, mediante la tinción de anexina-5 FITC PI, se añadan de 10 a los sextos espermatozoides a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Lavar las celdas con 500 microlitros de PBS frío. Luego, centrifugue la suspensión de espermatozoides y deseche el sobrenadante antes de volver a suspender las células en 200 microlitros de tampón de unión.
A continuación, agregue dos microlitros de anexina-5 FITC y dos microlitros de PI. Agite suavemente las células e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad antes de colocarlas en el citómetro de flujo para su análisis. Para el análisis del potencial de membrana mitocondrial, o MMP, utilizando la sonda JC-1, agregue dos veces 10 a los seis espermatozoides a un tubo de 1,5 mililitros y una centrífuga. Después de la centrifugación, vuelva a suspender la suspensión de espermatozoides en una solución de trabajo JC-1 de un mililitro.
Agite suavemente las células e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. De nuevo, centrifugar la suspensión, desechar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con un mililitro de PBS. Luego, vuelva a suspender los espermatozoides teñidos en un mililitro de PBS en un tubo de citómetro de flujo e inmediatamente coloque el tubo en el citómetro de flujo para su análisis.
A continuación, use cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona, o CCCP como control positivo. Vuelva a suspender los espermatozoides en un mililitro de solución de trabajo CCCP y realice un vórtice suave antes de incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación, centrifugue la suspensión, deseche el sobrenadante y realice los pasos para analizar la MMP utilizando la sonda JC-1 como se demuestra.
Para el ensayo de estructura de cromatina espermática, o SCSA, descongele la muestra de semen a un baño de agua a 37 grados Celsius y diluya con tampón TNE a una concentración de una a dos veces 10 a la sexta célula por mililitro. A continuación, agregue 200 microlitros de la muestra diluida a un tubo de ensayo de citómetro de flujo y mézclelo con 400 microlitros de solución ácida. Tiñir la muestra con 1,2 mililitros de solución de naranja de acridina.
Utilice una muestra de referencia como patrón interno para la configuración y calibración del citómetro de flujo. Diluir la muestra con cuatro grados Celsius de tampón TNE a una concentración de una a dos veces 10 a la sexta celda por mililitro, y realizar los pasos para SCSA, como se demuestra. Abra el software del citómetro de flujo e inicie el citómetro.
Para recopilar datos de muestra, cargue una muestra de control en el citómetro de flujo y haga clic en Ejecutar para iniciar la recopilación de datos. Cree diagramas de puntos para ver los datos. Seleccione los parámetros del eje XY y visualice lineal para especificar los datos.
A continuación, seleccione y aplique una puerta poligonal para delinear la población de espermatozoides para su análisis. Para la apoptosis de los espermatozoides, establezca FL1 como el eje X y FL2 como el eje Y. Luego, para aislar las células apoptóticas o necróticas vivas, toque y arrastre la puerta del cuadrante para reducir las poblaciones de espermatozoides a cuatro poblaciones específicas.
Para MMP, establezca FL1 como el eje X y FL2 como el eje Y. A continuación, crea una puerta poligonal para crear un subconjunto de las poblaciones de espermatozoides en dos poblaciones específicas. Para SCSA, establezca FL4 como el eje X y FL1 como el eje Y.
Dibuje la puerta, establezca un ángulo de 45 grados para excluir las señales de desechos celulares. Calcule 10.000 espermatozoides para cada muestra para análisis de apoptosis espermática, MMP y SCSA, establezca un límite de ejecución para indicar cuándo dejar de recopilar datos, tasa de fluídicidad, según el número de células y el umbral para eliminar los residuos y el ruido. Aplique esta configuración a todas las muestras.
Si es necesario, ajuste la compensación de color para corregir el desbordamiento fluorescente. Pipetee suavemente la muestra antes de cargarla en el citómetro de flujo. A continuación, introduzca el nombre de la muestra y haga clic en Ejecutar.
Una vez completada la ejecución, guarde los datos de ejemplo como archivo FCS proporcionando un nombre de archivo para su posterior análisis. Aquí se muestra la medición de la apoptosis de los espermatozoides mediante la tinción de anexina-cinco FITC PI. Este análisis incluyó el control negativo de espermatozoides no teñidos para establecer la compensación y los cuadrantes.
En una muestra con apoptosis espermática, los resultados se expresaron como los porcentajes de células apoptóticas o apoptóticas tempranas viables o vivas, apoptóticas tardías y necróticas. Aquí se muestra la subpoblación de espermatozoides con MMP alta y baja. Una muestra de semen de buena calidad mostró alta fluorescencia naranja y baja fluorescencia verde.
Por el contrario, una muestra de semen de mala calidad demostró una baja fluorescencia naranja y una alta fluorescencia verde. Aquí se muestran los citogramas SCSA de un hombre fértil e infértil. La población de espermatozoides se identificó como normal con alta estabilidad del ADN, índice de fragmentación del ADN y restos celulares.
La muestra de semen debe incubarse a 37 grados centígrados y licuarse completamente durante un máximo de una hora.
