Denna teknik presenterar ett praktiskt tillvägagångssätt för att uppskatta multipla humana spermiers funktionella biomarkörer genom flödescytometri utan betydande kompromiss med experimentkvaliteten inducerad av förlängda väntetider. Denna teknik kan vara en praktisk och tillförlitlig verktygslåda för diagnos av infertilitet och utvärdering av spermiefunktion vid både bänk och säng, och komplettera den rutinmässiga spermieundersökningen. Denna procedur utförs med Accuri C6-plattformen och den kan tillämpas på andra kommersiella plattformar med mindre modifieringar.
Börja med att inkubera spermaprovet vid 37 grader Celsius och gör provet helt flytande i en timme. För att räkna spermierna, blanda det flytande spermaprovet noggrant, tillsätt sedan 10 mikroliter sperma i en spermieräkningskammare och skanna objektglaset i en spermieklassanalysator. Räkna minst sex områden och 400 spermier för att uppskatta spermiekoncentrationen.
För detektion av spermieapoptos, med hjälp av annexin-5 FITC PI-färgning, tillsätt 10 till de sjätte spermierna till ett 1,5 ml centrifugrör. Tvätta cellerna med 500 mikroliter kall PBS. Centrifugera sedan spermiesuspensionen och kassera supernatanten innan du åter suspenderar cellerna i 200 mikroliter bindningsbuffert.
Tillsätt sedan två mikroliter FITC-annexin-5 och två mikroliter PI. Virvla försiktigt cellerna och inkubera dem i 15 minuter i rumstemperatur i mörker innan de placeras i flödescytometern för analys. För analys av mitokondriell membranpotential, eller MMP, med JC-1-sond, tillsätt två gånger 10 till de sjätte spermierna till ett 1,5 milliliters rör och centrifugera. Efter centrifugeringen suspenderas spermiesuspensionen på nytt i en 1 ml JC-1 arbetslösning.
Virvla försiktigt cellerna och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius i mörker. Centrifugera suspensionen igen, kassera supernatanten och tvätta pelleten två gånger med en milliliter PBS. Svimma sedan de färgade spermierna i en milliliter PBS i ett flödescytometerrör och placera omedelbart röret i flödescytometern för analys.
Använd sedan karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon eller CCCP som en positiv kontroll. Slamma upp spermierna på nytt i en milliliter CCCP-arbetslösning och virvla försiktigt innan de inkuberas i rumstemperatur i 20 minuter. Efter inkubation, centrifugera suspensionen, kassera supernatanten och utför stegen för att analysera MMP med hjälp av JC-1-sonden enligt demonstrationen.
För spermiekromatinstrukturanalys, eller SCSA, tina spermaprovet vid ett vattenbad på 37 grader Celsius och späd med TNE-buffert till en koncentration av en till två gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter. Tillsätt sedan 200 mikroliter av det utspädda provet till ett flödescytometerprovrör och blanda det med 400 mikroliter syralösning. Färga provet med 1,2 ml akridinorange lösning.
Använd ett referensprov som intern standard för flödescytometerinställning och kalibreringar. Späd provet med fyra grader Celsius TNE-buffert till en koncentration av en till två gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter och utför stegen för SCSA, som visas. Öppna flödescytometerns programvara och starta cytometern.
För att samla in sample data, ladda en kontroll sample på flödescytometern och klicka på Kör för att starta datainsamlingen. Skapa punktdiagram för att visa data. Välj XY-axelparametrar och visa linjär för att ange data.
Välj sedan och använd en polygonal grind för att avgränsa spermiepopulationen för analys. För spermieapoptos, ställ in FL1 som X-axeln och FL2 som Y-axeln. Sedan, för att isolera de levande apoptotiska eller nekrotiska cellerna, tryck och dra kvadrantgrinden för att delmängd av spermiepopulationerna ner till fyra specifika populationer.
För MMP anger du FL1 som X-axel och FL2 som Y-axel. Skapa sedan en polygonal grind för att dela upp spermiepopulationerna till två specifika populationer. För SCSA anger du FL4 som X-axel och FL1 som Y-axel.
Rita grinden, ställ in en 45-graders vinkel för att utesluta cellulära skräpsignaler. Beräkna 10 000 spermier för varje prov för spermieapoptos, MMP- och SCSA-analyser, ställ in en körgräns för att indikera när du ska sluta samla in data, fluidikhastighet, beroende på cellantal och tröskel för att eliminera skräp och brus. Använd de här inställningarna för alla exempel.
Om det behövs ställer du in färgkompensationen för att korrigera fluorescerande spillover. Pipettera försiktigt tillbaka sample innan du laddar den på flödescytometern. Ange sedan exempelnamnet och klicka på Kör.
När körningen är klar sparar du exempeldata som FCS-fil genom att ange ett filnamn för ytterligare analys. Mätningen av spermiernas apoptos med hjälp av annexin-five FITC PI-färgning visas här. Denna analys inkluderade negativ kontroll av ofärgade spermier för att ställa in kompensation och kvadranter.
I ett prov med spermieapoptos uttrycktes resultaten som procentandelar av livskraftiga eller levande tidiga apoptotiska eller apoptotiska, sena apoptotiska och nekrotiska celler. Spermiesubpopulationen med hög och låg MMP visas här. Ett spermaprov av god kvalitet visade hög orange och låg grön fluorescens.
Omvänt visade ett spermaprov av dålig kvalitet låg orange och hög grön fluorescens. SCSA-cytogrammen från en fertil och infertil man visas här. Spermiepopulationen identifierades som normal med hög DNA-stabilitet, DNA-fragmenteringsindex och cellrester.
Spermaprovet måste inkuberas vid 37 grader Celsius och göras fullständigt flytande i upp till en timme.