एससीओपीई 2 एंटीबॉडी के बिना हजारों एकल स्तनधारी कोशिकाओं से हजारों प्रोटीन की मात्रा निर्धारित कर सकता है। यह प्रोटोकॉल प्रोटिओम विषमता को उजागर करने में मदद कर सकता है जो अन्यथा थोक विश्लेषण के लिए अदृश्य होगा। एससीओपीई 2 दृष्टिकोण का उपयोग करके एकल सेल प्रोटिओमिक्स को शोधकर्ताओं के लिए संसाधनों की एक श्रृंखला के साथ सुलभ होने के लिए डिज़ाइन किया गया था, सिर्फ एक पिपेट से तरल हैंडलिंग रोबोटिक्स तक।
एससीओपीई 2 व्यापक रूप से कैंसर और इम्यूनोलॉजी सहित कई शोध क्षेत्रों पर लागू होता है, इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान करके कि प्रोटीन एक ही आबादी से एकल कोशिकाओं के बीच बहुतायत में कैसे अंतर करते हैं। शुरू करने के लिए, थर्मल साइकलर में क्रमबद्ध एकल कोशिकाओं के साथ 384-वेल प्लेट रखकर सेल लाइसिस प्रक्रिया शुरू करें, इसे 90 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्म करें और फिर 12 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें। प्लेट को 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर बेंचटॉप प्लेट स्पिनर में थोड़ी देर के लिए घुमाएं।
18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर एक वॉटर बाथ सोनिकेटर में पांच मिनट के लिए प्लेट को सोनिकेट करें। फिर, इसे बर्फ पर रखें। ट्रिप्सिन पाचन के साथ आगे बढ़ने के लिए, मास्टर मिक्स के 100 माइक्रोलीटर तैयार करें और तरल हैंडलर का उपयोग करके 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिक्स के 0.2 माइक्रोलीटर जोड़ें।
प्लेट को पांच सेकंड के लिए सील करें, और 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर बेंचटॉप प्लेट स्पिनर में घुमाएं। 384-वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए गर्म करें, ढक्कन तापमान 52 डिग्री सेल्सियस निर्धारित किया गया है। एक अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैगिंग प्रतिक्रिया सेट करने के लिए, माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से टेंडम मास टैग के 85 मिलीमोलर स्टॉक लें।
उन्हें खोलने से पहले, ट्यूबों को कमरे के तापमान पर गर्म करें और लेबल को निर्जल एसिटोनिट्राइल में 22 मिलीमोल तक पतला करें। इस लेबलिंग रणनीति का उपयोग करते हुए, तरल वितरण रोबोट या मैनुअल पिपेट का उपयोग करके, 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग के 0.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को पांच सेकंड के लिए सील करें, और 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर बेंचटॉप प्लेट स्पिनर में घुमाएं।
लेबलिंग प्रतिक्रिया को एक घंटे के लिए 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने दें। अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैगिंग प्रतिक्रिया के शमन के लिए, तरल हैंडलर का उपयोग करके 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचपीएलसी-ग्रेड पानी में पतला 0.5% हाइड्रॉक्सिलमाइन के 0.2 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को पांच सेकंड के लिए सील करें, और प्लेट को 30 मिनट के लिए 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले बेंचटॉप प्लेट स्पिनर में घुमाएं।
एलसी-एमएस विश्लेषण की तैयारी माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से संयुक्त वाहक या संदर्भ सामग्री को हटाकर शुरू की जाती है। प्रत्येक सेट के लिए, वाहक और संदर्भ सामग्री के एक माइक्रोलीटर को पहले कुएं में डालें, एक एकल सेट का हिस्सा होगा। पिपेट पहले कुएं से बाद के कुएं तक की पूरी मात्रा का उपयोग करें।
एक कुएं से दूसरे कुएं तक पूरी मात्रा को पाइप करना जारी रखें जब तक कि एक ही सेट में शामिल सभी कुओं को अंतिम कुएं में जोड़ नहीं दिया जाता है। प्रत्येक सेट के लिए, प्रत्येक सेट में शामिल होने वाले पहले एकल सेल वेल के लिए एचपीएलसी-ग्रेड पानी में पतला 50% एसिटोनिट्राइल के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। पिपेट पहले कुएं से बाद के कुएं तक की पूरी मात्रा का उपयोग करें।
एक सेल से दूसरे सेल में पूरी मात्रा को पाइप करना जारी रखें, जब तक कि एक ही सेट में शामिल सभी कुओं को अंतिम कुएं में जोड़ नहीं दिया जाता है। अब प्रत्येक सेट को उनके ऑटोसैंपलर ग्लास इंसर्ट में स्थानांतरित करें। सभी सेटों को संयुक्त करने और ग्लास इंसर्ट में रखने के बाद नमूने को सुखाएं।
एलसी-एमएस-एमएस विश्लेषण से पहले, लेबल पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक सेट में 0.1% फॉर्मिक एसिड के 1.2 माइक्रोलीटर जोड़ें। ऑटोसैंपलर को ग्लास ऑटोसैंपलर शीशियों में डालें, और प्रत्येक नमूने को एक टोपी के साथ बंद करें। प्रत्येक शीशी को पांच सेकंड के लिए वोर्टेक्स करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि रिस्पेंशन पूरा हो गया है, और फिर 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर एक शीशी स्पिनर में स्पिन करें।
सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना किनारों पर छिड़कने के बजाय सम्मिलित के निचले भाग में है। ऑटोसैंपलर ट्रे में शीशियों को रखें और प्रत्येक सेट के लिए, एलसी-एमएस-एमएस विश्लेषण के लिए एक माइक्रोलीटर नमूना इंजेक्ट करें। एकल कोशिकाओं की पाचन और लेबलिंग दक्षता को वाहक के साथ सीधे परख नहीं किया जा सकता है, लेकिन डीओ-एमएस सॉफ्टवेयर ऐसे भूखंड प्रदान करता है जो पाचन और लेबलिंग दक्षता का अनुमान लगाते हैं।
खराब पाचन को उनके पूरी तरह से क्लीवर समकक्षों के लिए गलत पेप्टाइड्स की तीव्रता के उच्च अनुपात से संकेत मिलता है। सेट में विचार करने के लिए एक और कारक प्रत्येक अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैगिंग चैनल में औसत रिपोर्टर आयन तीव्रता में लापता डेटा का अंश है। जब एकल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक तैयार किया जाता है, तो प्रति सेल लापता डेटा और सकारात्मक नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण नमूनों की तुलना में बहुत कम होते हैं।
एलसी-एमएस-एमएस नमूना तैयारी के दौरान सावधानीपूर्वक तरल हैंडलिंग पेप्टाइड्स की अधिकतम वसूली के लिए महत्वपूर्ण है। आइसोबेरिक वाहक का उपयोग करके प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए लगभग 100 पिकोग्राम से 100 नैनोग्राम प्रति कुएं के छोटे नमूने तैयार किए जा सकते हैं। एससीओपीई 2 केवल सामान्य अभिकर्मकों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके दुनिया भर के शोधकर्ताओं के लिए एकल-सेल प्रोटिओमिक्स माप सुलभ बनाता है।
यह रोबोटिक तरल हैंडलिंग द्वारा मैनुअल प्रसंस्करण या उच्च थ्रूपुट स्वचालन के लिए उत्तरदायी है।
