SCoPE2 kan kvantifiera tusentals proteiner från tusentals enskilda däggdjursceller utan antikroppar. Detta protokoll kan hjälpa till att avslöja proteom heterogenitet som annars skulle vara osynlig för bulkanalyser. Encellsproteomik, med hjälp av SCoPE2-metoden, utformades för att vara tillgänglig för forskare med en rad resurser, från bara en pipett till robotik för vätskehantering.
SCoPE2 är brett tillämpbart på många forskningsområden, inklusive cancer och immunologi, genom att ge insikt i hur proteiner är olika i överflöd mellan enskilda celler från samma population. För att börja, starta celllysproceduren genom att placera en 384-brunnsplatta med sorterade enskilda celler i den termiska cyklern, värma den i 10 minuter vid 90 grader Celsius följt av kylning vid 12 grader Celsius. Snurra ner plattan kort i en bänkskivasnurra vid 18 till 22 grader Celsius.
Sonicate plattan i fem minuter i ett vattenbad sonicator vid 18 till 22 grader Celsius. Lägg den sedan på is. För att fortsätta med trypsindigestion, förbered 100 mikroliter av masterblandningen och tillsätt 0,2 mikroliter masterblandning till varje brunn på 384-brunnsplattan med en vätskehanterare.
Försegla plattan, virveln i fem sekunder och snurra ner i en bänkskivaspinnare vid 18 till 22 grader Celsius. Värm 384-brunnsplattan i tre timmar vid 37 grader Celsius med locktemperaturen inställd på 52 grader Celsius. För att ställa in en tandemmassmärkningsreaktion, ta de 85 millimolära lagren av tandemmasstaggar ur frysen minus 80 grader Celsius.
Innan du öppnar dem, värm rören till rumstemperatur och späd etiketterna till 22 millimol i vattenfri acetonitril. Använd denna märkningsstrategi, tillsätt 0,5 mikroliter utspädda tandemmasstaggar till varje brunn på 384-brunnsplattan, med antingen en vätskedoseringsrobot eller en manuell pipett. Försegla plattan, virveln i fem sekunder och snurra ner i en bänkskivaspinnare vid 18 till 22 grader Celsius.
Låt märkningsreaktionen fortsätta vid 18 till 22 grader Celsius i en timme. För släckning av tandemmassmärkningsreaktion, tillsätt 0,2 mikroliter 0,5% hydroxylamin, utspädd i HPLC-vatten av HPLC-kvalitet, till varje brunn på 384-brunnsplattan med hjälp av en vätskehanterare. Försegla plattan, virveln i fem sekunder och snurra ner i en bänkskivaspinnare innan du håller plattan vid 18 till 22 grader Celsius i 30 minuter.
LC-MS-analysberedningen startas genom att ta bort den kombinerade bäraren eller referensmaterialet från frysen minus 80 grader Celsius. För varje uppsättning, pipettera en mikroliter bärare och referensmaterial i den första brunnen, kommer att ingå i en enda uppsättning. Pipettera hela volymen från den första brunnen till den efterföljande brunnen.
Fortsätt pipettera hela volymen från en brunn till nästa tills alla brunnar som ingår i en enda uppsättning har kombinerats i den slutliga brunnen. För varje uppsättning, tillsätt fem mikroliter 50% acetonitril utspädd i HPLC-vatten för den första encellsbrunnen som ska ingå i varje uppsättning. Pipettera hela volymen från den första brunnen till den efterföljande brunnen.
Fortsätt pipettera hela volymen från en cell till nästa tills alla brunnar som ingår i en enda uppsättning har kombinerats i den slutliga brunnen. Överför nu varje uppsättning till deras autosamplerglasinsatser. Torka proverna när alla uppsättningar har kombinerats och placerats i glasinsatser.
Före LC-MS-MS-analys, tillsätt 1,2 mikroliter 0,1% myrsyra till varje uppsättning för att återsuspendera de märkta peptiderna. Placera autosamplerinsatserna i injektionsflaskor med autosampler i glas och stäng varje prov med ett lock. Virvla varje injektionsflaska i fem sekunder för att se till att resuspensionen är klar och snurra sedan ner i en injektionsflaska vid 18 till 22 grader Celsius.
Se till att varje prov är längst ner på insatsen i stället för att stänkas på sidorna. Placera injektionsflaskorna i autosamplerfacket och injicera ett prov på en mikroliter för LC-MS-MS-analys för varje uppsättning. Matsmältning och märkningseffektivitet hos de enskilda cellerna kanske inte analyseras direkt som med bäraren, men DO-MS-programvaran tillhandahåller diagram som uppskattar matsmältnings- och märkningseffektiviteten.
Dålig matsmältning indikeras av ett högt förhållande mellan intensiteten hos missklyvda peptider och deras helt klyvda motsvarigheter. En annan faktor att tänka på i uppsättningarna är bråkdelen av saknade data i medianreporterns jonintensitet i varje tandemmassmärkningskanal. När enstaka celler framgångsrikt förbereds är saknade data per cell och positiv kontroll mycket lägre än negativa kontrollprover.
Noggrann vätskehantering under LC-MS-MS-provberedning är avgörande för maximal återvinning av peptider. Små prover av cirka 100 pikogram till 100 nanogram per brunn kan förberedas för proteomikanalys med hjälp av en isobarisk bärare. SCoPE2 gör encellsproteomikmätningar tillgängliga för forskare över hela världen genom att endast använda vanliga reagenser och kommersiellt tillgänglig utrustning.
Det är mottagligt för manuell bearbetning eller automatisering med hög genomströmning genom robotvätskehantering.
