Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. erkänner stöd från NIH R33 CA225458 och R35 GM119455. Vi tackar Kettenbach- och Gerber-laboratorierna för deras hjälpsamma diskussion.

OBS: Genereringen av PIBs görs enligt beskrivningen av Moorhead et al., där 1 mg mikrocystin och cirka 6 ml sepharos är kopplade för att generera PIBs med en bindningskapacitet på upp till 5 mg / ml17.
1. Beredning av prover
OBS: En typisk utgångsmängd för PIB-MS är 1 mg totalt protein per tillstånd. För detta experiment användes cirka 2,5 x 106 HeLa-celler för att extrahera 1 mg protein. Denna beräknin...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS är en kemisk proteomikmetod som används för att kvantitativt profilera PPPome från olika provkällor i en enda analys. Mycket arbete har gjorts med hjälp av kinashämmare pärlor för att studera kinomet och hur det förändras i cancer och andra sjukdomstillstånd 10,11,12,13. Ändå ligger studien av PPPome bakom. Vi förväntar oss att detta tillvägagångssätt kan fylla detta g...

Proteinfosforylering styr de flesta cellulära processer, inklusive men inte begränsat till svaret på DNA-skador, tillväxtfaktorsignalering och passagen genom mitos 1,2,3. I däggdjursceller fosforyleras majoriteten av proteinerna vid en eller flera serin-, treonin- eller tyrosinrester vid någon tidpunkt, med fosfoseriner och fosfotreoniner som utgör cirka 98% av alla fosforyleringsställen 2,3. Medan kinaser har studerats omfattande inom cellulär signalering, är PPP: s roll i regleringen av dynamiska cellulära processer fortfarande framväxande.
Fosforyleringsdynamiken styrs av det dynamiska samspelet mellan kinaser och fosfataser. I däggdjursceller finns det mer än 400 proteinkinaser som katalyserar serin / treoninfosforylering. Över 90% av dessa platser defosforyleras av fosfoproteinfosfataser (PPP), en liten familj av enzymer som består av PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT och PPZ 2,3. PP1 och PP2A är ansvariga för majoriteten av fosfoserin och fosfotreonin defosforylering inom en cell 2,3,4. Den anmärkningsvärda skillnaden i antal mellan kinaser och fosfataser och bristen på specificitet hos PPP-katalytiska subenheter in vitro ledde till tron att kinaser är den viktigaste determinanten för fosforylering 2,3. Emellertid, flera studier har visat fosfataser för att fastställa substratspecificitet genom bildandet av multimera holoenzymer 5,6,7,8,9. Till exempel är PP1 en heterodimer som består av en katalytisk underenhet och vid en given tidpunkt en av de mer än 150 reglerande underenheterna 6,7,8. Omvänt är PP2A en heterotrimer som bildas av en byggnadsställning (A), en reglerande (B) och en katalytisk (C) underenhet 2,3,9. Det finns fyra distinkta familjer av PP2A-regulatoriska underenheter (B55, B56, PR72 och striatin), var och en med flera gener, skarvvarianter och lokaliseringsmönster 2,3,9. Offentlig-privata partnerskapens multimeriska karaktär fyller gapet i antalet kinaser och PPP-katalytiska underenheter. Det skapar dock analytiska utmaningar för att studera PPP-signalering. För att omfattande analysera PPP-signalering är det viktigt att undersöka de olika holoenzymerna i en cell eller vävnad. Stora framsteg har gjorts för att studera det mänskliga släktomet genom användning av kinashämmare pärlor, kallade multiplexhämmare pärlor eller kinobeads, en kemisk proteomisk strategi där kinashämmare immobiliseras på pärlor och masspektrometri används för att identifiera berikade kinaser och deras interagerare 10,11,12,13.
Vi har etablerat ett liknande tillvägagångssätt för att studera PPP-biologi. Denna teknik involverar affinitetsfångst av PPP-katalytiska underenheter med användning av pärlor med en immobiliserad, icke-selektiv PPP-hämmare som kallas mikrocystin-LR (MCLR) som kallas fosfatashämmarepärlor (PIBs)14,15. Till skillnad från andra metoder som kräver endogen märkning eller uttryck av exogena PPP-underenheter som kan förändra proteinaktivitet eller lokalisering, möjliggör PIB-MS anrikning av endogena PPP-katalytiska underenheter, deras associerade reglerande och byggnadsställningar och interagerande proteiner (kallat PPPome) från celler och vävnader vid en given tidpunkt eller under specifika behandlingsförhållanden. MCLR hämmar PP1, PP2A, PP4-6, PPT och PPZ vid nanomolära koncentrationer, vilket gör PIBs mycket effektiva vid anrikning för PPPome16. Denna metod kan skalas för användning på vilket utgångsmaterial som helst från celler till kliniska prover. Här beskriver vi i detalj användningen av PIB och masspektrometri (PIB-MS) för att effektivt fånga, identifiera och kvantifiera det endogena PPPome och dess modifieringstillstånd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Bild 1: Visuell sammanfattning av PIB-MS-protokollet. I ett PIB-MS-experiment kan prover erhållas i olika former, från celler till tumörer. Provet samlas in, lyseras och homogeniseras före PPP-anrikning. För att berika för PPP inkuberas lysaten med PIBs med eller utan en PPP-hämmare, såsom MCLR. PDB tvättas sedan och växtskyddsmedel elueras under denatureringsförhållanden. Proverna bereds för masspektrometrianalys genom avlägsnande av tvättmedel genom SP3-proteinanrikning, tryptisk matsmältning och avsaltning. Prover kan sedan valfritt TMT-märkas före masspektrometrianalys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
PIB-MS involverar lys och förtydligande av celler eller vävnader, inkubation av lysaten med PIBs, eluering och analys av eluatet via western blotting eller masspektrometribaserade metoder (Figur 1). Tillägget av fri MCLR kan användas som en kontroll för att skilja specifika PIB-bindemedel från icke-specifika interagerare. För de flesta applikationer kan ett etikettfritt tillvägagångssätt användas för att direkt identifiera proteiner i eluater. I de fall där större precision i kvantifieringen eller identifieringen av arter med låg förekomst behövs, kan ytterligare bearbetning med tandem-masstagg (TMT) -märkning användas för att öka täckningen och minska inmatningen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

De flesta cellulära processer regleras av dynamisk proteinfosforylering. Mer än tre fjärdedelar av proteinerna fosforyleras och fosfoproteinfosfataser (PPP) samordnar över 90% av all cellulär serin/ treonin defosforylering. Avreglering av proteinfosforylering har varit inblandad i patofysiologin för olika sjukdomar, inklusive cancer och neurodegeneration. Trots sin utbredda aktivitet är de molekylära mekanismer som styr växtskyddsmedel och de som kontrolleras av växtskyddsmedel dåligt karakteriserade. Här beskrivs ett proteomiskt tillvägagångssätt som kallas fosfatasinhibitorpärlor och masspektrometri (PIB-MS) för att identifiera och kvantifiera PPP, deras posttranslationella modifieringar och deras interagerare på så lite som 12 timmar med hjälp av någon cellinje eller vävnad. PIB-MS använder en icke-selektiv PPP-hämmare, mikrocystin-LR (MCLR), immobiliserad på sepharospärlor för att fånga och berika endogena PPP och deras associerade proteiner (kallad PPPome). Denna metod kräver inte exogent uttryck av märkta versioner av växtskyddsmedel eller användning av specifika antikroppar. PIB-MS erbjuder ett innovativt sätt att studera de evolutionärt bevarade PPP:erna och utöka vår nuvarande förståelse av defosforyleringssignalering.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figur 2: Identifiering av specifika PIBs-bindemedel. HeLa-celler i biologiskt tre exemplar behandlades antingen med DMSO eller PPP-hämmaren MCLR, inkuberades med PIB och analyserades via LC-MS/MS. (B) Vulkandiagram för PIB-MS-analys i DMSO och MCLR-behandlade HeLa-celllysater, med specifika P...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Här presenterar vi ett protokoll för anrikning av endogena fosfoproteinfosfataser och deras interagerande proteiner från celler och vävnader och deras identifiering och kvantifiering genom masspektrometribaserad proteomik.

En masspektrometribaserad metod för att identifiera fosfoproteinfosfataser och deras interagerare

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS är en ny teknik som används för att berika för endogena fosforproteinfosfataser och de interagerar proteiner från celler och vävnader. Det involverar identifiering och kvantifiering av dessa proteiner med hjälp av masspektrometribaserad proteomik. Denna teknik kräver inte exogent uttryck av taggade versioner av fosforproteinfosfataser som kan förändra proteinaktivitet eller lokalisering.Det använder inte heller antikroppar som kan vara ospecifika eller oförmögna att skilja mellan specifika isoformer. Denna metod för att undersöka PPPM kan skalas för användning på allt från celler till kliniska prover. För att börja, samla cellpellets genom centrifugering vid 277 gånger g i två minuter vid rumstemperatur.Ta bort media och tvätta cellerna med fem milliliter PBS. Förbered lysbufferten enligt beskrivningen i textprotokollet och håll dig på is. Tillsätt en milliliter kyld lysbuffert till proverna, homogenisera sedan proverna genom sonifiering och håll cellerna på is mellan pulserna.Överför lysatterna till färska 1,5 ml rör. Centrifugera det soniska provet vid 21, 130 gånger g i 15 minuter vid 4 grader Celsius. Använd en alikvot av lysaten för att kvantifiera den totala proteinkoncentrationen med hjälp av en bicinchonininsyraanalys.Detta steg är viktigt för att säkerställa lika proteinkoncentration i varje prov. För en kontroll av fosfoproteinfosfatashämmare, förbered två alikvoter med lika proteinkoncentration för varje prov. Lysbuffert kan användas för att späda ut proverna så att varje rör har lika proteinkoncentration.Tillsätt en mikromolar fri mikrocystin-LR till en alikvot och en lika stor volym DMSO till den andra. Virvla proverna och inkubera dem på is i 15 minuter. Beredning av fosfatashämmarepärlorna bör utföras i förväg eller under inkubationsstegen som beskrivs i provberedningsavsnittet.Använd 10 mikroliter av fasta fosfatashämmare pärlor, eller PIB-harts, för ett milligram protein och tillsätt dem till ett 1,5-milliliter rör. Tvätta PIBs tre gånger med 0,5 ml lysbuffert genom virvel följt av centrifugering vid 376 gånger g i 30 sekunder vid rumstemperatur. Tillsätt en lämplig mängd lysbuffert till de tvättade PIB:erna för att göra 50 volymprocent PIB-buffertlösning.Blanda genom att försiktigt pipettera och virvla pipettspetsen och uppslamningen för att återsuspendera PIBs. Överför 20 mikroliter av uppslamningen till ett 1,5 ml rör innehållande 0,5 ml lysbuffert. Snurra rören vid 376 gånger g i 30 sekunder.Varje rör innehåller lika stora volymer PIBs i det. Kassera supernatanten medan du bara lämnar det fasta hartset och upp till 50 mikroliter lysbuffert i varje rör. Överför lysatterna till de lämpligt märkta rören som innehåller PIBs.Inkubera lysaten med PIBs i en timme vid 4 grader Celsius med rotation vid 8 rpm. Efter inkubation med lysaten, centrifugera PIBs vid 376 gånger g i 30 sekunder vid 4 grader Celsius och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna genom att tillsätta 0,5 ml lysbuffert och invertera rören Samla pärlorna genom centrifugering och ta bort supernatanten.Upprepa detta steg för totalt tre tvättar. Efter den sista tvätten, ta bort lysbufferten så mycket som möjligt utan att pipettera upp PIB: erna. Förbered elueringsbufferten som innehåller 2 % SDS och tillsätt elueringsbufferten fyra till fem gånger volymen PIBs.Inkubera vid 65 grader Celsius i en timme för att eluera fosfoproteinfosfataserna från pärlorna. Centrifugera rören vid 376 gånger g i 30 sekunder vid rumstemperatur. Samla eluatet i ett separat rör och fortsätt för masspektrometrianalyser eller western blotting.För att regenerera PIBs, inkubera dem i 2% SDS-lösning med rotation vid 8 rpm i en timme vid rumstemperatur. Tvätta pärlorna tre till fem gånger i 25 millimolar Tris-HCl pH 7,5 med rotation i 30 minuter per tvätt. Förvara PIBs i 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 med natriumazid.För masspektrometrianalys varierar metoderna för datafiltrering och analys och kan utföras av forskaren eller en kärnanläggning. När du har sökt rådata mot en artspecifik proteomdatabas filtrerar du sökresultaten och exporterar dem som ett Microsoft Excel-kalkylblad. Analysera data i tre exemplar.För etikettfri kvantifiering, använd MS1-toppareamätningar för att kvantifiera data. För att identifiera PPP-underenheter och deras interagerare de novo, jämför biologiska tredubblar av mikrocystin-LR-inhiberade och DMSO-behandlade prover. Filtrera data så att endast proteiner med ett totalt peptidantal på mer än en av minst två av de tre DMSO-kontrollbehandlade proverna är närvarande.För att filtrera bort proteiner som icke-specifikt binder till hartset, ta bort proteinerna i vilka det totala peptidantalet i det mikrocystin-LR-behandlade tillståndet är högre än för någon PPP-katalytisk underenhet. Uteslut vanliga föroreningar som keratin, kollagen, ribosomala proteiner och heterogena nukleära ribonukleoproteiner från analysen. En CSV-fil är viktig för att importera data till Perseus.Importera filtrerade data till Perseus genom att klicka på Generisk matrisuppladdning i avsnittet Läs in. Transformera data genom att gå till Grundläggande transformering, välja data och ange transformeringsfunktionen som loggbas 2 av x. Impute saknade värden från en normalfördelning genom att gå till Imputation, Ersätt saknade värden från normalfördelning, välja data och ange bredd och nedväxling för beräkningen.Utför kvantil normalisering genom att gå till Normalisera, Kvantil normalisering. Kommentera data genom att gå till Annot-rader, Kategoriska anteckningsrader. Utför studentens T-test genom att gå till Tester, Tvåprovstester, välja grupper, testet som ska utföras och metoden för korrigering av flera hypoteser som används för trunkering.Denna funktion beräknar också log 2-förhållandena. Fosfoproteinfosfotater och deras interagerare identifierades i HeLa-cellerna med hjälp av ett PIB-pull-down-experiment, följt av etikettfri kvantifiering av proteinmängd i DMSO-behandlade och mikrocystin-LR-behandlade prover. Vulkandiagram för masspektrometrianalys identifierade specifika PIB-bindemedel som visas i röda, katalytiska underenheter i blått och nya kandidat PPP-underenheter, eller interagerande proteiner, i vitt.Icke-specifika bindemedel visades i grått. Spridningsdiagram över log2-arean från den DMSO-behandlade HeLa-celllysaten visade att förekomsterna var starkt korrelerade, vilket indikerar reproducerbarhet av data. Nätverksanalys av alla fosforproteinfosfatasunderenheter och interagerande proteiner visade att dessa proteiner var specifika interagerare i PIB-neddragningen.Globala proteomikanalyser kan utföras och resultaten jämföras med PIB-analysen för att avgöra om PPPome-sammansättningen drivs av PPP-överflöd eller regleras av posttranslationsmekanismer. PIB-MS är ett brett tillämpligt verktyg som har gjort det möjligt för oss att identifiera skillnader i PPP-uttrycksmönster under olika förhållanden som interfas kontra mitotiska prover eller skillnader mellan cancercellinjer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem vätskekromatografi-masspektrometri baserad strategi för metabolit analys av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

En råtta metyl-Seq plattform att identifiera epigenetiska förändringar i samband med Stress exponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Användning av Grafix för påvisande av transienta interactorer av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...