Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K., NIH R33 CA225458 ve R35 GM119455'in desteğini kabul eder. Kettenbach ve Gerber laboratuvarlarına yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz.

NOT: PIB'lerin üretimi, Moorhead ve ark. tarafından tanımlandığı gibi yapılır; burada 1 mg mikrosistin ve yaklaşık 6 mL sefaroz, 5 mg / mL17'ye kadar bağlanma kapasitesine sahip PIB'ler üretmek için birleştirilir.
1. Numune hazırlama
NOT: PIB-MS için tipik bir başlangıç miktarı, durum başına 1 mg toplam proteindir. Bu deney için, 1 mg proteini çıkarmak için yaklaşık 2.5 x 106 HeLa hücresi...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS, PPPome'u çeşitli numune kaynaklarından tek bir analizde kantitatif olarak profillemek için kullanılan kimyasal bir proteomik yaklaşımdır. Kinomu incelemek için kinaz inhibitörü boncukları kullanarak ve kanser ve diğer hastalık durumlarında nasıl değiştiğini incelemek için çok fazla çalışma yapılmıştır10,11,12,13. Yine de, PPPome çalışması geride kalıyor....

Protein fosforilasyonu, DNA hasarına verilen yanıt, büyüme faktörü sinyallemesi ve mitoz 1,2,3'ten geçiş dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çoğu hücresel süreci kontrol eder. Memeli hücrelerinde, proteinlerin çoğunluğu bir veya daha fazla serin, treonin veya tirozin kalıntısında fosforile edilir, fosfoserlerin ve fosfotreoninler tüm fosforilasyon bölgelerinin yaklaşık% 98'ini oluşturur 2,3. Kinazlar hücresel sinyalizasyonda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, PPP'lerin dinamik hücresel süreçlerin düzenlenmesindeki rolü hala ortaya çıkmaktadır.
Fosforilasyon dinamikleri, kinazlar ve fosfatazlar arasındaki dinamik etkileşim ile kontrol edilir. Memeli hücrelerinde, serin / treonin fosforilasyonunu katalize eden 400'den fazla protein kinaz vardır. Bu bölgelerin% 90'ından fazlası, PP1, PP2A, PP2B, PP4-7,PPT ve PPZ 2,3'ten oluşan küçük bir enzim ailesi olan fosfoprotein fosfatazlar (PPP'ler) tarafından defosforile edilir. PP1 ve PP2A, bir hücre 2,3,4 içindeki fosfoserin ve fosfotreonin defosforilasyonunun çoğundan sorumludur. Kinazlar ve fosfatazlar arasındaki kayda değer sayı farkı ve PPP katalitik alt birimlerinin in vitro özgüllüğünün olmaması, kinazların fosforilasyonun ana belirleyicisi olduğu inancına yol açmıştır 2,3. Bununla birlikte, birçok çalışma, fosfatazların multimerik holoenzimlerinoluşumu yoluyla substrat özgüllüğünü oluşturduğunu göstermiştir 5,6,7,8,9. Örneğin, PP1, katalitik bir alt birimden ve belirli bir zamanda, 150'den fazla düzenleyici alt birim 6,7,8'den birinden oluşan bir heterodimerdir. Tersine, PP2A, bir iskele (A), bir düzenleyici (B) ve bir katalitik (C) alt birimi 2,3,9'dan oluşan bir heterotrimerdir. PP2A düzenleyici alt birimlerinin (B55, B56, PR72 ve striatin) dört ayrı ailesi vardır, her biri birden fazla gen, ekleme varyantı ve lokalizasyon paternleri 2,3,9'dur. PPP'lerin multimerik doğası, kinazların ve PPP katalitik alt birimlerinin sayısındaki boşluğu doldurur. Bununla birlikte, PPP sinyallemesini incelemek için analitik zorluklar yaratır. PPP sinyalini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için, bir hücre veya doku içindeki çeşitli holoenzimleri araştırmak çok önemlidir. İnsan kinomunun incelenmesinde, multipleks inhibitör boncuklar veya kinoboncuklar olarak adlandırılan kinaz inhibitörü boncukların kullanılmasında, kinaz inhibitörlerinin boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirildiği ve zenginleştirilmiş kinazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisinin kullanıldığı kimyasal bir proteomik strateji kullanılarak büyük ilerlemeler kaydedilmiştir10,11,12,13.
PPP biyolojisini incelemek için benzer bir yaklaşım oluşturduk. Bu teknik, fosfataz inhibitörü boncuklar (PIB'ler) olarak adlandırılan mikrosistin-LR (MCLR) adı verilen hareketsiz, seçici olmayan bir PPP inhibitörü ile boncuklar kullanılarak PPP katalitik alt birimlerinin afinite yakalamasını içerir14,15. Protein aktivitesini veya lokalizasyonunu değiştirebilecek eksojen PPP alt birimlerinin endojen etiketlemesini veya ekspresyonunu gerektiren diğer yöntemlerden farklı olarak, PIB-MS, endojen PPP katalitik alt birimlerinin, bunlarla ilişkili düzenleyici ve iskele alt birimlerinin ve belirli bir zaman noktasında veya belirli tedavi koşulları altında hücrelerden ve dokulardan etkileşime giren proteinlerin (PPPome olarak adlandırılır) zenginleştirilmesine izin verir. MCLR, nanomolar konsantrasyonlarda PP1, PP2A, PP4-6, PPT ve PPZ'yi inhibe ederek PIB'leri PPPome16 için zenginleştirmede oldukça etkili hale getirir. Bu yöntem, hücrelerden klinik örneklere kadar herhangi bir başlangıç materyalinde kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir. Burada, endojen PPPome ve modifikasyon durumlarını verimli bir şekilde yakalamak, tanımlamak ve ölçmek için PIB'lerin ve kütle spektrometresinin (PIB-MS) kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Şekil 1: PIB-MS protokolünün görsel özeti. Bir PIB-MS deneyinde, hücrelerden tümörlere kadar çeşitli şekillerde örnekler elde edilebilir. Numune, PPP zenginleştirmeden önce toplanır, lize edilir ve homojenize edilir. PPP'ler için zenginleştirmek için, lizat, MCLR gibi bir PPP inhibitörü olan veya olmayan PIB'lerle inkübe edilir. PIB'ler daha sonra yıkanır ve PPP'ler denatüre koşullarında salınır. Numuneler, SP3 protein zenginleştirme, triptik sindirim ve tuzdan arındırma yoluyla deterjanların uzaklaştırılması yoluyla kütle spektrometresi analizi için hazırlanır. Numuneler daha sonra kütle spektrometresi analizinden önce isteğe bağlı olarak TMT etiketli olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
PIB-MS, hücrelerin veya dokuların lizisini ve berraklaştırılmasını, lizatın PIB'lerle inkübasyonunu, elüsyonu ve batı lekelenmesi veya kütle spektrometrisine dayalı yaklaşımlarla elüatın analizini içerir (Şekil 1). Serbest MCLR'nin eklenmesi, spesifik PIB bağlayıcılarını spesifik olmayan interaktörlerden ayırt etmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. Çoğu uygulama için, elüatlardaki proteinleri doğrudan tanımlamak için etiketsiz bir yaklaşım kullanılabilir. Nicelemede veya düşük bolluktaki türlerin tanımlanmasında daha fazla hassasiyetin gerekli olduğu durumlarda, kapsama alanını artırmak ve girişi azaltmak için tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme ile daha fazla işlem kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

Çoğu hücresel süreç dinamik protein fosforilasyonu ile düzenlenir. Proteinlerin dörtte üçünden fazlası fosforile edilir ve fosfoprotein fosfatazlar (PPP'ler) tüm hücresel serin / treonin defosforilasyonunun% 90'ından fazlasını koordine eder. Protein fosforilasyonunun serbestleştirilmesi, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patofizyolojisinde rol oynamıştır. Yaygın aktivitelerine rağmen, PPP'leri kontrol eden moleküler mekanizmalar ve PPP'ler tarafından kontrol edilenler zayıf karakterizedir. Burada, fosfataz inhibitörü boncukları ve kütle spektrometresi (PIB-MS) olarak adlandırılan proteomik bir yaklaşım, PPP'leri, posttranslasyonel modifikasyonlarını ve interaktörlerini herhangi bir hücre hattı veya dokusunu kullanarak 12 saat kadar kısa bir sürede tanımlamak ve ölçmek için tanımlanmıştır. PIB-MS, endojen PPP'leri ve bunlarla ilişkili proteinleri (PPPome olarak adlandırılır) yakalamak ve zenginleştirmek için sefaroz boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilmiş, seçici olmayan bir PPP inhibitörü olan mikrosistin-LR (MCLR) kullanır. Bu yöntem, PPP'lerin etiketli versiyonlarının eksojen ekspresyonunu veya spesifik antikorların kullanılmasını gerektirmez. PIB-MS, evrimsel olarak korunmuş PPP'leri incelemek ve mevcut defosforilasyon sinyalizasyonu anlayışımızı genişletmek için yenilikçi bir yol sunmaktadır.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Şekil 2: Spesifik PIB bağlayıcılarının tanımlanması . (A) PIB-MS ile çeşitli doku tipleri veya hücreler analiz edilebilir. Biyolojik üçlüdeki HeLa hücreleri DMSO veya PPP inhibitörü MCLR ile tedavi edildi, PIB'lerle inkübe edildi ve LC-MS / MS ile analiz edildi. (B) DMSO ve MC...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS, endojen fosforprotein fosfatazları zenginleştirmek için kullanılan yeni bir tekniktir ve hücrelerden ve dokulardan proteinlerle etkileşime girerler. Kütle spektrometrisine dayalı proteomikler kullanılarak bu proteinlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesini içerir. Bu teknik, protein aktivitesini veya lokalizasyonunu değiştirebilecek fosforprotein fosfatazların etiketli versiyonlarının eksojen ekspresyonunu gerektirmez.Ayrıca, spesifik olmayan veya spesifik izoformlar arasında ayrım yapamayan antikorlar kullanmaz. PPPM'yi araştırmak için kullanılan bu yöntem, hücrelerden klinik örneklere kadar her şeyde kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir. Başlamak için, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 277 kez g'de santrifüjleme yoluyla hücre peleti toplayın.Ortamları çıkarın ve hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi lizis tamponunu hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Numunelere bir mililitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin, ardından numuneleri sonifikasyon ile homojenize edin ve hücreleri darbeler arasında buz üzerinde tutun.Lisatları taze 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Sonikleştirilmiş numuneyi 21, 130 kez g'de 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin. Bir biskinkoninik asit testi kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatın bir alikotunu kullanın.Bu adım, her numunede eşit protein konsantrasyonu sağlamak için gereklidir. Bir fosfoprotein fosfataz inhibitörü kontrolü için, her numune için eşit protein konsantrasyonunda iki alikot hazırlayın. Lizis tamponu, numuneleri seyreltmek için kullanılabilir, böylece her tüp eşit protein konsantrasyonuna sahip olur.Bir alikot'a bir mikromolar serbest mikrosistin-LR ve diğerine eşit miktarda DMSO ekleyin. Numuneleri vorteks edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Fosfataz inhibitörü boncukların hazırlanması, önceden veya numune hazırlama bölümünde açıklanan inkübasyon adımları sırasında yapılmalıdır.Bir miligram protein için 10 mikrolitre katı fosfataz inhibitörü boncuk veya PIB reçinesi kullanın ve bunları 1.5 mililitrelik bir tüpe ekleyin. PIB'leri vorteksleme ile 0,5 mililitre lizis tamponu ile üç kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüjleme yapın. Yıkanmış PIB'lere uygun miktarda lizis tamponu ekleyerek hacimce %50 PIB tampon çözeltisi elde edin.Pipetleme yaparak hafifçe karıştırın ve PIB'leri yeniden askıya almak için pipet ucunu ve bulamacı döndürün. Bulamacın 20 mikrolitresini, 0,5 mililitre lizis tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpleri 30 saniye boyunca 376 kez g'de döndürün.Her tüp içinde eşit miktarda PIB içerir. Her tüpte sadece katı reçine ve 50 mikrolitreye kadar lizis tamponu bırakırken süpernatantı atın. Lisatları, PIB'leri içeren uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın.Lisatı PIB'lerle 4 santigrat derecede bir saat boyunca 8 rpm'de dönme ile inkübe edin. Lisat ile inkübasyondan sonra, PIB'leri 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları 0,5 mililitre lizis tamponu ekleyerek ve tüpleri ters çevirerek yıkayın Boncukları santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın.Toplam üç yıkama için bu adımı tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PIB'leri pipetlemeden lizis tamponunu mümkün olduğunca çıkarın. % 2 SDS içeren elüsyon tamponunu hazırlayın ve elüsyon tamponunu PIB'lerin hacminin dört ila beş katı kadar ekleyin.Fosfoprotein fosfatazları boncuklardan çıkarmak için bir saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüj yapın. Elüatı ayrı bir tüpe toplayın ve kütle spektrometresi analizleri veya batı lekelenmesi için devam edin.PIB'leri yeniden oluşturmak için, oda sıcaklığında bir saat boyunca 8 rpm'de dönerek %2 SDS çözeltisinde inkübe edin. Boncukları 25 milimolar Tris-HCl pH 7.5'te üç ila beş kez, yıkama başına 30 dakika döndürerek yıkayın. PIB'leri sodyum azid ile 25 milimolar Tris HCL pH 7.5'te saklayın.Kütle spektrometresi analizi için, veri filtreleme ve analiz yöntemleri değişir ve araştırmacı veya çekirdek bir tesis tarafından gerçekleştirilebilir. Ham verileri türe özgü bir proteom veritabanında aradıktan sonra, arama sonuçlarını filtreleyin ve bir Microsoft Excel çalışma sayfası olarak dışa aktarın. Verileri üçlü olarak analiz edin.Etiketsiz niceleme için, verileri ölçmek üzere MS1 tepe alanı ölçümlerini kullanın. PPP alt birimlerini ve bunların interaktörleri de novo'yu tanımlamak için, mikrosistin-LR ile inhibe edilmiş ve DMSO ile muamele edilmiş örneklerin biyolojik üçlüslerini karşılaştırın. Verileri, DMSO kontrolüyle tedavi edilen üç numunenin en az ikisinde yalnızca toplam peptid sayısı birden fazla olan proteinlerin mevcut olması için filtreleyin.Reçineye spesifik olarak bağlanmayan proteinleri filtrelemek için, mikrosistin-LR ile tedavi edilen durumdaki toplam peptid sayısının herhangi bir PPP katalitik alt biriminden daha yüksek olduğu proteinleri çıkarın. Keratin, kollajen, ribozomal proteinler ve heterojen nükleer ribonükleoproteinler gibi yaygın kirleticileri analizden hariç tutun. Verileri Perseus'a aktarmak için bir CSV dosyası gereklidir.Yük bölümünde Genel matris yükleme'yi tıklayarak filtrelenmiş verileri Perseus'a aktarın. Temel Dönüşüm'e giderek, verileri seçerek ve dönüştürme işlevini x'in günlük tabanı 2 olarak belirterek verileri dönüştürün. Atama, Normal dağılımdaki eksik değerleri değiştir, verileri seçerek ve hesaplama için genişliği ve vites küçültmeyi belirterek normal bir dağılımdaki eksik değerleri ima et.Normalleştir, Kantil normalleştirme'ye giderek kantil normalleştirme gerçekleştirin. Not satırlarına, Kategorik ek açıklama satırlarına giderek verilere açıklama ekleyin. Testlere, İki örneklemli testlere giderek, grupları, gerçekleştirilecek testi ve kesme için kullanılan çoklu hipotez testi düzeltme yöntemini seçerek öğrencinin T testini gerçekleştirin.Bu işlev aynı zamanda log 2 oranlarını da hesaplar. Fosfoprotein fosfotatlar ve bunların interaktörleri, bir PIB pull-down deneyi kullanılarak HeLa hücrelerinde tanımlandı, ardından DMSO ile tedavi edilen ve mikrosistin-LR ile muamele edilen örneklerde protein bolluğunun etiketsiz nicelleştirilmesi izlendi. Kütle spektrometrisi analizinin volkan grafiği, kırmızı, mavi renkte katalitik alt birimler ve beyaz renkte yeni aday PPP alt birimleri veya etkileşime giren proteinlerle gösterilen spesifik PIB bağlayıcılarını tanımladı.Spesifik olmayan bağlayıcılar gri renkte gösterildi. DMSO ile muamele edilen HeLa hücre lizatından log2 alanının dağılım grafiği, bollukların yüksek oranda ilişkili olduğunu ve verilerin tekrarlanabilirliğini gösterdiğini göstermiştir. Tüm fosforprotein fosfataz alt birimlerinin ve etkileşen proteinlerin ağ analizi, bu proteinlerin PIB pull-down'daki spesifik interaktörler olduğunu göstermiştir.Küresel proteomik analizler yapılabilir ve sonuçlar, PPPome kompozisyonunun PPP bolluğu tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini veya çeviri sonrası mekanizmalar tarafından düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için PIB analizi ile karşılaştırılabilir. PIB-MS, interfaz ve mitotik örnekler veya kanser hücre hatları arasındaki farklılıklar gibi çeşitli koşullar altında PPP ekspresyon modellerindeki farklılıkları tanımlamamızı sağlayan geniş çapta uygulanabilir bir araçtır.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare metil-Seq Platform

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...