Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

نحن نقدر جميع المؤلفين المشاركين في Jiang et al. 2020 للمساهمة في تطوير منهجية SCAD13. نشكر الدكتور ستيفن ديتزل ومرفق التصوير الحيوي الأساسي في جامعة لودفيغ ماكسيميلان على الوصول إلى نظام الفوتون المتعدد. تم دعم Y.R. من قبل مؤسسة Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21) ، ومنحة مجلس البحوث الأوروبي الموحد (ERC-CoG 819933) ، ومؤسسة LEO (LF-OC-21-000835).

يقدم النموذج المعروض أدناه وصفا مفصلا خطوة بخطوة لجيل فحص SCAD كما هو موضح بإيجاز في Jiang et al.، 202013. تم إجراء تحضيرات عينة SCAD بعد التضحية بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية وحكومة بافاريا العليا. تم إيواء الحيوانات في منشأة الحيوانات في مركز هيلمهولتز في ميونيخ. تم الحفاظ ?...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

تم بالفعل تطوير العديد من النماذج لفهم تكوين الندبات بعد الإصابة. وفي حين أحرز الكثير من أوجه التقدم في هذا الصدد، فإن الآليات الفعلية لا تزال غير واضحة. على النقيض من التقنية السابقة ، يتضمن نموذج SCAD جميع أنواع الخلايا والطبقات الجلدية ، وبالتالي الحفاظ على تعقيد الجلد الأصلي18,1...

التئام الجروح هو عملية لاستعادة الجروح المخترقة. تؤدي إصابات الأنسجة في اللافقاريات إلى تجديد جزئي أو كامل. في المقابل، تستجيب الثدييات للإصابات العميقة عن طريق التندب، وهي عملية مصممة خصيصا لإغلاق الجروح بسرعة باستخدام سدادات كثيفة من ألياف المصفوفة التي تقلل من المنطقة المخترقة وفي الوقت نفسه تشوه الموقع المصاب بشكل دائم1،2،3. حروق الجلد الكبيرة أو الجروح المفتوحة العميقة في الثدييات تؤدي إلى أنماط ظاهرية مرضية مثل الندوب الضخامية أو الجدرة 4,5. هذه الندوب الوفيرة تسبب عبئا هائلا على أنظمة الرعاية الصحية السريرية والعالمية. في الولايات المتحدة وحدها ، تكلف إدارة الندوب حوالي 10 مليارات دولار سنويا 6,7. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير منهجيات ذات صلة لفهم العمليات والآليات الأساسية التي ينطوي عليها تكوين الندبات بشكل أفضل.
في السنوات الأخيرة ، كشفت مجموعة واسعة من الدراسات التي أجريت على الفئران عن مجموعات من الخلايا الليفية غير المتجانسة ذات القدرات الوظيفية المتميزة بناء على أصولها في مواقع جلدية معينة8،9،10. في الجلد الخلفي ، حدد Rinkevich et al. ، 2015 ، أن مجموعة محددة من الخلايا الليفية مع تعبير جنيني مبكر عن Engrailed-1 (En1) ، تسمى EPF (Engrailed positive Fibroblast) تساهم في تندب الجلد عند الجرح. وعلى العكس من ذلك، فإن سلالة أخرى من الخلايا الليفية ليس لها تاريخ من التعبير المتشابك، وهي الخلايا الليفية السلبية المسننة (ENF)، لا تساهم في تكوين الندبة8. يسمح رسم خرائط المصير لهذه السلالات En1 باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تحركها Cre والتي تم عبورها إلى خطوط ماوس مراسل التألق مثل R26 mTmG (En1Cre x R26mTmG) بتصور مجموعات EPF و ENF.
دراسة هجرة الخلايا الليفية في الجسم الحي على مدى عدة أيام محدودة بسبب القيود الأخلاقية والتقنية. علاوة على ذلك ، فإن شاشات مكتبة الأجسام المضادة المركبة والفيروسية والمحايدة لتعديل المسارات المشاركة في الندوب تمثل تحديا تقنيا. تفتقر النماذج المستخدمة سابقا في المختبر أو خارج الجسم الحي إلى القدرة على تصور هجرة الخلايا الليفية وتكوين الندبات في البيئات الدقيقة للبشرة الحقيقية ، والتوحيد في تطور الندبة ، بالإضافة إلى تعقيد الأنسجة التي تحاكي بيئات الجلد في الجسم الحي 11,12. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير اختبار تندب خارج الجسم الحي يسمى SCAD (الأنسجة الشبيهة ب SCar في طبق) 13،14. يمكن إجراء هذا الفحص البسيط عن طريق استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم الذي يحتوي على البشرة والأدمة ومناطق اللفافة تحت الجلد وزراعتها في وسائط DMSO المكملة بالمصل لمدة تصل إلى 5 أيام. الندوب الناتجة عن SCAD تكرر بشكل موثوق السمات المميزة للنسخ والبروتينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن SCADs الناتجة عن خطوط الفئران المعدلة وراثيا ذات الصلة (على سبيل المثال ، الفئران En1) التي تم عبورها مع خطوط فأر مراسل الفلورسنت تسمح بتصور ديناميكيات هجرة الخلايا الليفية وتطوير الندوب بدقة غير مسبوقة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة لأي تطبيقات عالية الإنتاجية (على سبيل المثال ، المكتبة المركبة أو مكتبة الأجسام المضادة أو الفحص الفيروسي)13،14. في هذه المقالة ، نصف بروتوكولا محسنا لإنشاء SCADs وتطبيقات المعالجة اللاحقة لدراسة ديناميكيات الخلايا والمصفوفة في تطوير الندبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

إن استجابة الثدييات العالمية لسد جروح الأنسجة العميقة هي من خلال تكوين الندبات وتقلص الأنسجة ، بوساطة الخلايا الليفية المتخصصة في اللفافة. على الرغم من الأهمية السريرية لتشكيل الندوب وضعف التئام الجروح ، فإن فهمنا لديناميكيات الخلايا الليفية اللفافة في التئام الجروح سريع بسبب عدم وجود فحوصات ذات صلة تمكن من التصور المباشر لتصميم رقصات الخلايا الليفية والديناميكيات في البيئات المعقدة مثل جروح الجلد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتوليد ندوب جلدية خارج الموقع باستخدام SCAD أو "أنسجة تشبه SCar في طبق" تحاكي البيئة المعقدة للجروح الجلدية. في هذا الفحص ، يتم استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم وزراعته رأسا على عقب في الوسائط لمدة 5 أيام ، تتطور خلالها الندوب وتقلصات الجلد بشكل موحد. تتيح هذه المنهجية، إلى جانب نماذج الفئران المعدلة وراثيا الخاصة بسلالة الخلايا الليفية، تصور سلالات الخلايا الليفية الفردية عبر عملية إصلاح الجرح بأكملها. بشكل عام ، يساعد هذا البروتوكول الباحثين في فهم العمليات والآليات الأساسية لإصلاح الجروح ، واستكشاف آثار المعدلات مباشرة على نتائج التئام الجروح.

يمكن فصل توليد SCADs إلى ثلاث خطوات أساسية: حصاد الجلد مرة أخرى من الفئران P0-P1 ، وتوليد لكمات خزعة كاملة السماكة ، وزراعة لاحقة من السكادس الفردية تصل إلى 5 أيام في 96 لوحة بئر. كقراءة ، يمكن تطبيق هذا الفحص بشكل أكبر لتحليل الجوانب المكانية والزمنية للتندب. يستخدم التحليل المكاني 2D و 3D وضع العل?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

يصف هذا البروتوكول توليد نبات اللفافة الجلدية المسمى "SCar مثل الأنسجة في طبق" أو SCAD. يسمح هذا النموذج بتصور غير مسبوق للخلايا الليفية المفردة أثناء تكوين الندبة.

تصور تطور الندبة باستخدام فحص SCAD - فحص تندب الجلد خارج الموقع الطبيعي

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

تفتقر النماذج المستخدمة سابقا في المختبر أو خارج الجسم الحي إلى مكونات الخلايا الجلدية وتعقيد أنسجة الجلد. يتغلب اختبار SCAD خارج الموقع الطبيعي على قيود محددة ويتيح دراسة تطور الندوب خارج الحيوان المصاب. يسمح فحص SCAD بتصور هجرة الخلايا الليفية وتكوين الندبات في البيئات الدقيقة للجلد.وهي تمكن مكتبات فحص المنشطات أو المثبطات من فهم الأساس الميكانيكي لتشكيل الندوب. فحوصات فحص عالية الإنتاجية للمكتبات المسطحة باستخدام نموذج SCAD في فهم العملية الأساسية ومسار الجزيء المتضمن في إصلاح الجروح. من السهل إجراء فحص SCAD باستخدام الجلد الظاهر.للحصول على ندبة ثابتة، يوصى باختيار بشرة اليوم صفر أو اليوم الأول بعد الولادة. بعد التضحية بجرو حديثي الولادة بعد يوم الصفر أو اليوم الأول ، استخدمي مشرطا جراحيا معقما لاستئصال الجلد الظهري الظهري الكامل السماكة 1.5 × 1.5 سم بعناية حتى طبقة العضلات الهيكلية. قشر الجلد باستخدام ملقط منحني معقم ، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسوس الكامنة.اغسل الأنسجة المستأصلة ب 50 إلى 100 ملليلتر من وسط DMEM F-12 البارد لإزالة الدم الملوث. ثم اغسل الأنسجة بمحلول الملح المتوازن Hanks للحفاظ على بقاء الأنسجة والخلايا. ضع الجلد رأسا على عقب مع لفافة سطحية في الأعلى في طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على وسط DMEM F-12.ثم، باستخدام لكمة خزعة يمكن التخلص منها بمليمترين، قم باستئصال قطع الجلد المستديرة كاملة السماكة لتوليد أنسجة جربية، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسية الكامنة حتى البشرة. أضف 200 ميكرولتر من DMEM F-12 الطازج وسط كامل بدون أحمر الفينول في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل الأنسجة الفردية المجعدة وغمرها بالكامل رأسا على عقب إلى آبار صفيحة 96 بئرا.انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها في ظل ظروف قياسية. في اليومين الثاني والرابع من الثقافة، قم بإزالة الوسط تاركا 10 ميكرولترات في البئر وأضف وسيطا كاملا جديدا من DMEM F-12 تم تسخينه مسبقا إلى جانب مركبات العلاج للحفاظ على استمرار ظروف بقاء الخلايا والأنسجة. للتصوير الحي ل SCADs ، قم بإعداد 30 ملليلتر من محلول الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 2 إلى 3٪ في PBS في زجاجة زجاجية عن طريق التسخين في الميكروويف.بعد الغليان ، انقل الزجاجة على الفور وقم بتبريد محلول الأغاروز السائل في حمام مائي 40 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل أنسجة SCAD مع لفافة أو ندبة متجهة لأعلى إلى وسط طبق 35 ملم. ثم قم بتضمين SCAD في درجة حرارة الغرفة عن طريق سكب الأغاروز السائل 40 درجة مئوية ببطء على الأنسجة باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر.يتبلمر Agarose في غضون دقيقتين. بعد البلمرة ، أضف ملليلتر من المتوسط الكامل DMEM F-12 المسخن مسبقا. ثم باستخدام مجهر متحد البؤرة أو متعدد الفوتونات مجهز بأنظمة حضانة مناسبة موضحة في المخطوطة ، احصل على صور بفاصل زمني من اليوم صفر إلى اليوم الأول.لحصاد الأنسجة ، اغسل الأنسجة في النقاط الزمنية ذات الصلة عن طريق استبدال الوسائط ب PBS معقمة. باستخدام ملقط معقم ، انقل كل SCAD إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde لإصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS قبل الانتقال إلى تلطيخ التألق المناعي ثنائي أو ثلاثي الأبعاد كما هو موضح في مخطوطة النص.يتم عرض صور الحقول الساطعة التمثيلية الكاملة ل SCADs في اليومين صفر وخمسة هنا. يكشف تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لأقسام الأنسجة الرأسية عن بصمات تندب الأنسجة وتقلص الأنسجة وتراكم المصفوفة خارج الخلية في قلب الندبة في اليومين صفر وخامسة. يتم عرض تلطيخ التألق المناعي ل SCADs في اليومين صفر و 5.من ندبة المرحلة المبكرة والمتأخرة ، تظهر الخلايا الليفية الإيجابية المتأصلة باللون الأخضر والخلايا الليفية السلبية المتأصلة باللون الأحمر. بالنسبة للتصوير ثلاثي الأبعاد ، تم تضمين الأنسجة في محلول الأغاروز وتعلوها PBSGT. توضح الصور التمثيلية التوطين الحصري لبروتين N-cadherin في موقع الندبة في اليوم الخامس من SCAD.عرض إعداد التصوير ثلاثي الأبعاد للفاصل الزمني المجهز بغرفة حضانة الأحداث المبكرة لتطور أسراب الخلايا الليفية خلال ال 12 ساعة الأولى أو المراحل المبكرة من تطور الندبة. يتم عرض التمثيل الرسومي للمسارات الخلوية المتعقبة أحادية الخلية للخلايا الليفية الفردية على تطور الندبة هنا. من الأهمية بمكان وضع أنسجة SCAD رأسا على عقب داخل صفيحة البئر بحيث تواجه اللفافة لأعلى.ومن شأن عدم القيام بذلك أن يؤدي إلى اختلافات لا مفر منها في أنماط الهجرة. يسمح هذا الإجراء بفحص طبقات الجلد للعلاجات أو الثقافة باستخدام المعدلات الكيميائية أو الأجسام المضادة المحايدة أو الطرق الفيروسية. هذا يساعد في تقييم الاستجابات الليفية المرضية عبر البيئات الطبية المتنوعة.أظهرنا التعبير عن connexin-43 و N-cadherin كجزيئات رئيسية تشارك في تعبئة اللفافة عند الجرح. تسمح منهجية SCAD بتحديد استراتيجيات علاجية جديدة للحد من الندوب والتليف.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

معايرة Coronaviruses الإنسان باستخدام الفحص Immunoperoxidase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

و في المختبر غزو الورم FluoroBlok الفحص

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

تقييم الوكلاء الذي يحفز هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية في الجلد بمقايسة كم

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...