Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Vi anerkender alle medforfatterne af Jiang et al. 2020 for at bidrage til udviklingen af SCAD-metoden13. Vi takker Dr. Steffen Dietzel og Bioimaging-kerneanlægget ved Ludwig-Maximilans-Universität for adgang til Multiphoton-systemet. Y.R. blev støttet af Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) og LEO Fondet (LF-OC-21-000835).

Modellen præsenteret nedenfor giver en detaljeret trinvis beskrivelse af genereringen af SCAD-assay som kort beskrevet i Jiang et al., 202013. SCAD-prøvepræparater blev udført efter ofring af dyrene i henhold til de internationale og øvre Bayerns regerings retningslinjer. Dyrene blev ophuset på dyreanlægget i Helmholtz Centre München. Værelserne blev opretholdt med optimal fugtighed og konstant temperatur med en 12 timers lyscyklus. Dyrene blev forsynet med mad og vand ad libitum...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Flere modeller er allerede udviklet til at forstå ardannelse efter skade. Selv om der er gjort mange fremskridt i denne henseende, men de faktiske mekanismer er stadig ikke klare. I modsætning til den tidligere teknik inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag og opretholder derved kompleksiteten af indfødt hud18,19. Denne metode er i stand til at generere grundlæggende datasæt, der er vigtige for at forstå molekylære mekanismer, der driver a...

Sårheling er en proces med restaurering af brudte sår. Vævsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fuldstændig regenerering. I modsætning hertil reagerer pattedyr på dyb skade ved ardannelse, en proces, der er skræddersyet til hurtigt at forsegle sår med tætte propper af matrixfibre, der minimerer det brudte område og samtidig permanent deformerer det skadede sted 1,2,3. Store hudforbrændinger eller dybe åbne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fænotyper såsom hypertrofiske eller keloide ar 4,5. Disse sprudlende ar forårsager en enorm byrde for kliniske og globale sundhedssystemer. Alene i USA koster arhåndtering omkring 10 milliarder dollars årligt 6,7. Derfor er det nødvendigt at udvikle relevante metoder for bedre at forstå de fundementale processer og mekanismer, der er involveret i ardannelse.
I de senere år har en bred vifte af undersøgelser i mus afsløret heterogene fibroblastpopulationer med forskellige funktionelle potenser baseret på deres oprindelse på visse hudsteder 8,9,10. I ryghud identificerede Rinkevich et al., 2015, at en specifik fibroblastpopulation med et tidligt embryonalt udtryk for Engrailed-1 (En1), betegnet EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrager til kutan ardannelse ved såring. Omvendt bidrager en anden fibroblast-slægt uden historie med engrailed ekspression, Engrailed negative fibroblast (ENF), ikke til ardannelse8. Skæbnekortlægning af disse En1-slægter ved hjælp af Cre-drevne transgene muselinjer krydset til fluorescensreportermuslinjer såsom R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) muliggør visualisering af EPF- og ENF-populationer.
At studere fibroblastmigration in vivo over flere dage er begrænset af etiske og tekniske begrænsninger. Desuden er sammensatte, virale og neutraliserende antistofbiblioteksskærme til modulering af veje, der er involveret i ardannelse, teknisk udfordrende. Tidligere anvendte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler evnen til at visualisere fibroblastmigration og ardannelse i ægte hudmikromiljøer, ensartethed i arudvikling samt vævskompleksitet, der efterligner in vivo-hudmiljøer 11,12. For at overvinde ovenstående begrænsninger udviklede vi et ex vivo ardannelsesassay nævnt SCAD (SCar-lignende væv i en skål)13,14. Dette enkle assay kan udføres ved at udskære 2 mm hud i fuld tykkelse, der indeholder epidermis, dermis og subkutane fasciaregioner og dyrke dem i serumstædsede DMSO-medier i op til 5 dage. Ar genereret fra SCAD replikerer pålideligt transkriptomiske og proteomiske kendetegn ved in vivo-ar. Derudover tillader SCAD'er genereret fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krydset med fluorescerende reportermuslinjer visualisering af fibroblastmigrationsdynamik og arudvikling i en hidtil uset opløsning. Desuden kan denne model let tilpasses til alle applikationer med høj gennemstrømning (f.eks. Sammensat bibliotek, antistofbibliotek eller viral screening)13,14. I denne artikel beskriver vi en optimeret protokol til at generere SCAD'er og efterfølgende downstream-behandlingsapplikationer til at studere cellulær og matrixdynamik i arudvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

Pattedyrs globale reaktion på forsegling af dybe vævssår er gennem ardannelse og vævskontraktion, medieret af specialiserede fasciafibroblaster. På trods af den kliniske betydning af ardannelse og nedsat sårheling er vores forståelse af fascia fibroblastdynamik i sårheling kortvarig på grund af manglen på relevante assays, der muliggør direkte visualisering af fibroblastkoreografi og dynamik i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papir præsenterer en protokol til generering af ex situ hudar ved hjælp af SCAD eller "SCar-lignende væv i en skål", der efterligner det komplekse miljø af hudsår. I dette assay udskæres 2 mm fuld tykkelse hud og dyrkes på hovedet i medier i 5 dage, hvor ar og hudkontrakturer udvikler sig ensartet. Denne metode kombineret med fibroblast-afstamningsspecifikke transgene musemodeller muliggør visualisering af individuelle fibroblastafstrigninger på tværs af hele sårreparationsprocessen. Samlet set hjælper denne protokol forskere med at forstå grundlæggende processer og mekanismer til sårreparation og direkte udforske virkningerne af modulatorer på sårhelingsresultater.

Generering af SCAD'er kan opdeles i tre vigtige trin: Høst af hud fra P0-P1-mus, generering af biopsistans i fuld tykkelse og efterfølgende dyrkning af individuelle scads op til 5 dage i plader med 96 brønde. Som en udlæsning kan dette assay yderligere anvendes til at analysere de rumlige og tidsmæssige aspekter af ardannelse. Den rumlige analyse anvender 2D og 3D immunmærkning af væv til at studere rumlig lokalisering af cellulære og matrixkomponenter inden for udvikling af arvæv. Spatiotemporale undersøgelser...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Denne protokol beskriver dannelsen af en hud-fascia-eksplantation nævnt "SCar-lignende væv i en skål" eller SCAD. Denne model tillader hidtil uset visualisering af enkeltfibroblaster under ardannelse.

Visualisering af arudvikling ved hjælp af SCAD-assay - Et ex-situ hudardannelsesassay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Tidligere anvendte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler dermale cellekomponenter og kompleksitet af hudvæv. Dette ex situ SCAD-assay overvinder en fast begrænsning og gør det muligt at studere udviklingen af ar uden for såret dyr. SCAD-analysen tillader visualisering af fibroblastmigration og ardannelse i hudmikromiljøer.Det gør det muligt at screene biblioteker af aktivatorer eller hæmmere for at forstå det mekanistiske grundlag for ardannelse. Screeningsanalyser med høj gennemstrømning af flade biblioteker ved hjælp af SCAD-modellen til forståelse af grundlæggende proces og molekylekurset involveret i sårreparation. SCAD-assayet er let at udføre ved hjælp af hududsendelserne.For konsekvent ar anbefales det at vælge postnatal dag nul eller dag en hud. Efter at have ofret postnatal dag nul eller dag en nyfødt hvalp, skal du bruge en steril kirurgisk skalpel til omhyggeligt at skære 1,5 ved 1,5 centimeter fuld tykkelse dorsal ryghud indtil skeletmuskellaget. Skræl huden ved hjælp af steril buet tang, og sikre, at den overfladiske fascia er intakt med den underliggende panniculus carnosus muskel.Vask det udskårne væv med 50 til 100 ml koldt DMEM F-12 medium for at fjerne forurenende blod. Vask derefter vævet med Hanks afbalanceret saltopløsning for at opretholde vævs- og cellelevedygtighed. Placer huden på hovedet med overfladisk fascia ovenpå i en 10 centimeter petriskål indeholdende DMEM F-12 medium.Derefter, ved hjælp af en engangs to millimeter biopsistans, udskærer runde hudstykker i fuld tykkelse for at generere scabbed væv, hvilket sikrer, at overfladisk fascia er intakt med underliggende panniculus carnosus muskel indtil epidermis. Tilsæt 200 mikroliter frisk DMEM F-12 komplet medium uden phenolrød i hver brønd på en 96-brønds plade. Brug steril tang til at overføre og nedsænke individuelt scabbed væv på hovedet til brøndene på en 96-brønds plade.Overfør pladen til en cellekulturinkubator, der opretholdes under standardbetingelser. På dyrkningens dag to og fire skal du fjerne mediet, der efterlader 10 mikroliter i brønden, og tilsæt frisk forvarmet DMEM F-12 komplet medium sammen med behandlingsforbindelserne for at opretholde fortsatte celle- og vævslevedygtighedsbetingelser. Til levende billeddannelse af SCAD'er fremstilles 30 ml 2 til 3% lavsmeltende agaroseopløsning i PBS i en glasflaske ved opvarmning i en mikrobølgeovn.Efter kogning overføres straks flasken og afkøles den flydende agaroseopløsning i et 40 grader Celsius vandbad. Overfør derefter SCAD-vævet med fascia eller ar, der vender opad til midten af en 35 millimeter skål. Indlejr derefter SCAD ved stuetemperatur ved langsomt at hælde 40 grader Celsius flydende agarose på vævet ved hjælp af en pipettespids på 1000 mikroliter.Agarose polymeriserer inden for to minutter. Efter polymerisation tilsættes to milliliter forvarmet DMEM F-12 komplet medium. Derefter skal du bruge et konfokalt eller et multifotonmikroskop udstyret med passende inkubationssystemer, der er forklaret i manuskriptet, erhverve time-lapse-billeder af dag nul til dag et.Ved vævshøstning vaskes vævene på relevante tidspunkter ved at erstatte mediet med steril PBS. Brug steril tang til at overføre hver SCAD til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 mikroliter 2% paraformaldehyd for at fiksere vævene natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag vaskes vævene tre gange med PBS, inden du fortsætter til to- eller tredimensionel immunofluorescensfarvning som beskrevet i tekstmanuskriptet.De repræsentative helmonterede lysfeltbilleder af SCAD'er på dag nul og fem er vist her. Massons trikromfarvning af lodrette vævssektioner afslører signaturer af vævsardannelse, vævskontraktion og ophobning af ekstracellulær matrix i arkernen på dag nul og fem. Immunofluorescensfarvningen af SCAD'er på dag nul og fem er vist.Fra tidligt og sent stadium ar, den indgroede positive fibroblast er vist i grønt og den indgroede negative fibroblast i rødt. Til tredimensionel billeddannelse blev væv indlejret i agaroseopløsning og toppet med PBSGT. De repræsentative billeder viser eksklusiv lokalisering af N-cadherinprotein på arstedet for en dag fem SCAD.Den tredimensionelle time lapse-billeddannelsesopsætning udstyret med et inkubationskammer viste tidlige hændelser med progression af fibroblastsværmene i løbet af de første 12 timer eller tidlige stadier af arudvikling. Den grafiske repræsentation af enkeltcellesporede cellulære baner af individuelle fibroblaster over arudvikling præsenteres her. Det er afgørende at placere SCAD-vævet på hovedet inde i brøndpladen, så fascien vender opad.Undladelse af at gøre dette ville resultere i uundgåelige variationer i migrationsmønstrene. Denne procedure gør det muligt at undersøge dermale lag til behandlinger eller dyrkning ved hjælp af kemiske modulatorer, neutraliserende antistoffer eller virale metoder. Dette hjælper med vurderingen af patologiske fibrotiske reaktioner på tværs af forskellige medicinske indstillinger.Vi viste ekspressionen af connexin-43 og N-cadherin som nøglemolekyler involveret i fasciamobilisering ved såring. SCAD-metoden gør det muligt at identificere nye terapeutiske strategier for at begrænse ardannelse og fibrose.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omdannelse af en ELISA til en Luminex xMAP assay under anvendelse af en multiplex antistof screeningsmetode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse af SNARE-medieret membranfusion anvendelse af en enzymatisk Cellefusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Måling Effekter af bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Behavior Ved hjælp af en Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Udvikling af en kvantitativ rekombinase Polymerase amplifikationsanalyse med et indre Positiv kontrol

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selektive GPCR Konformationer målt med FRET sensorer i en Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Evaluering af vaskulære Hyperpermeability-fremkaldende stoffer i huden med Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...