Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

We erkennen alle co-auteurs van Jiang et al. 2020 voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van SCAD-methodologie13. We bedanken Dr. Steffen Dietzel en de Bioimaging-kernfaciliteit aan de Ludwig-Maximilans-Universität voor de toegang tot het Multiphoton-systeem. Y.R. werd ondersteund door de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), de European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) en de LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Het onderstaande model geeft een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de generatie van SCAD-assay zoals kort beschreven in Jiang et al., 202013. SCAD-monsterpreparaten werden uitgevoerd na het offeren van de dieren volgens de internationale en de richtlijnen van de regering van Opper-Beieren. Dieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van het Helmholtz Centre München. De kamers werden onderhouden met een optimale luchtvochtigheid en constante temperatuur met een lichtcyclus van 12 uu...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om littekenvorming na letsel te begrijpen. Hoewel er in dit opzicht veel vooruitgang is geboekt, zijn de werkelijke mechanismen nog steeds niet duidelijk. In tegenstelling tot de vorige techniek bevat het SCAD-model alle celtypen en cutane lagen, waardoor de complexiteit van native skin18,19 behouden blijft. Deze methodologie is in staat om fundamentele datasets te genereren die belangrijk zijn voor het begrijpen van m...

Wondgenezing is een proces van herstel van gebroken wonden. Weefselletsels bij ongewervelde dieren resulteren in gedeeltelijke of volledige regeneratie. Daarentegen reageren zoogdieren op diep letsel door littekens, een proces dat is afgestemd op het snel afdichten van wonden met dichte pluggen van matrixvezels die het doorgebroken gebied minimaliseren en tegelijkertijd de gewonde site permanent vervormen 1,2,3. Grote brandwonden op de huid of diepe open wonden bij zoogdieren resulteren in pathologische fenotypen zoals hypertrofische of keloïde littekens 4,5. Deze uitbundige littekens veroorzaken een enorme belasting voor klinische en wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Alleen al in de VS kost littekenbeheer jaarlijks ongeveer $ 10 miljard 6,7. Daarom is de ontwikkeling van relevante methodologieën nodig om de fundementale processen en mechanismen die betrokken zijn bij littekenvorming beter te begrijpen.
In de afgelopen jaren heeft een breed scala aan studies bij muizen heterogene fibroblastpopulaties onthuld met verschillende functionele potenties op basis van hun oorsprong op bepaalde huidlocaties 8,9,10. In de achterhuid identificeerden Rinkevich et al., 2015, dat een specifieke fibroblastpopulatie met een vroege embryonale expressie van Engrailed-1 (En1), epf (engrailed positive fibroblast) genoemd, bijdraagt aan cutane littekens bij verwonding. Omgekeerd draagt een andere fibroblastlijn zonder voorgeschiedenis van ingebakken expressie, Engrailed negative fibroblast (ENF), niet bij aan littekenvorming8. Het in kaart brengen van deze En1-afstammingslijnen met behulp van Cre-gestuurde transgene muislijnen gekruist naar fluorescentie reporter muislijnen zoals R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) maakt visualisatie van EPF- en ENF-populaties mogelijk.
Het bestuderen van fibroblastmigratie in vivo gedurende meerdere dagen wordt beperkt door ethische en technische beperkingen. Bovendien is het technisch een technische uitdaging om samengestelde, virale en neutraliserende antilichaambibliotheekschermen te moduleren om routes te moduleren die betrokken zijn bij littekens. Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen het vermogen om fibroblastmigratie en littekenvorming in echte huidmicro-omgevingen, uniformiteit in littekenontwikkeling en weefselcomplexiteit die in vivo huidomgevingen emuleertte visualiseren 11,12. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een ex vivo littekentest genaamd SCAD (SCar-achtig weefsel in A Dish)13,14. Deze eenvoudige test kan worden uitgevoerd door een huid van 2 mm van volledige dikte met de epidermis, de dermis en de subcutane fasciaregio's te exciëren en deze gedurende maximaal 5 dagen te kweken in dmso-media met serumsupplement. Littekens gegenereerd door SCAD repliceren op betrouwbare wijze transcriptomische en proteomische kenmerken van in vivo littekens. Bovendien maken SCADs gegenereerd uit relevante transgene muislijnen (bijv. En1-muizen) gekruist met fluorescerende reportermuislijnen de visualisatie van fibroblastmigratiedynamiek en littekenontwikkeling met een ongekende resolutie mogelijk. Bovendien kan dit model eenvoudig worden aangepast voor toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. compound library, antilichaambibliotheek of virale screening)13,14. In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om SCADs en daaropvolgende downstream verwerkingstoepassingen te genereren om cellulaire en matrixdynamiek in littekenontwikkeling te bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

De wereldwijde reactie van zoogdieren op het afdichten van diepe weefselwonden is door littekenvorming en weefselcontractie, gemedieerd door gespecialiseerde fascia fibroblasten. Ondanks de klinische betekenis van littekenvorming en verminderde wondgenezing, is ons begrip van fascia fibroblastdynamica bij wondgenezing vluchtig vanwege het gebrek aan relevante assays die directe visualisatie van fibroblastchoreografie en -dynamiek in complexe omgevingen zoals in huidwonden mogelijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om ex-situ huidlittekens te genereren met behulp van SCAD of "SCar-achtig weefsel in A Dish" dat de complexe omgeving van huidwonden nabootst. In deze test wordt de huid van 2 mm van volledige dikte weggesneden en ondersteboven gekweekt in media gedurende 5 dagen, gedurende welke littekens en huidcontracturen zich uniform ontwikkelen. Deze methodologie, in combinatie met fibroblast-lineage specifieke transgene muismodellen, maakt visualisatie van individuele fibroblastlijnen over het hele wondherstelproces mogelijk. Over het algemeen helpt dit protocol onderzoekers bij het begrijpen van fundamentele processen en mechanismen van wondherstel, waarbij de effecten van modulatoren op wondgenezingsresultaten direct worden onderzocht.

Het genereren van SCADs kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen: het oogsten van de huid van P0-P1-muizen, het genereren van biopsieponsen van volledige dikte en de daaropvolgende kweek van individuele scads tot 5 dagen in 96-well platen. Als uitlezing kan deze test verder worden toegepast om de ruimtelijke en temporele aspecten van littekens te analyseren. De ruimtelijke analyse maakt gebruik van 2D- en 3D-immuunlabeling van weefsels om ruimtelijke lokalisatie van cellulaire en matrixcomponenten in zich ont...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Dit protocol beschrijft het genereren van een huid-fascia explant genaamd "SCar like tissue in A Dish" of SCAD. Dit model maakt een ongekende visualisatie van enkele fibroblasten mogelijk tijdens littekenvorming.

Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen dermale celcomponenten en complexiteit van huidweefsel. Deze ex situ SCAD-test overwint een bepaalde beperking en maakt het mogelijk om de ontwikkeling van littekens buiten het gewonde dier te bestuderen. De SCAD-test maakt visualisatie van fibroblastmigratie en littekenvorming in micro-omgevingen van de huid mogelijk.Het stelt screeningsbibliotheken van activatoren of remmers in staat om de mechanistische basis van littekenvorming te begrijpen. High-throughput screening assays van platte bibliotheken met behulp van het SCAD-model bij het begrijpen van fundamentele processen en het molecuultraject dat betrokken is bij wondherstel. De SCAD-test is eenvoudig uit te voeren met behulp van de huidexplantaten.Voor een consistent litteken wordt aanbevolen om postnatale dag nul of dag één huid te selecteren. Na het opofferen van postnatale dag nul of dag één pasgeboren pup, gebruik een steriel chirurgisch scalpel om zorgvuldig 1,5 bij 1,5 centimeter volledige dikte dorsale rughuid tot aan de skeletspierlaag te verwijderen. Pel de huid met behulp van steriele gebogen tang, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus spier.Was het weggesneden weefsel met 50 tot 100 milliliter koud DMEM F-12 medium om besmettelijk bloed te verwijderen. Was vervolgens het weefsel met Hanks gebalanceerde zoutoplossing om de levensvatbaarheid van weefsel en cellen te behouden. Leg de huid ondersteboven met oppervlakkige fascia bovenop in een petrischaaltje van 10 centimeter met DMEM F-12 medium.Snijd vervolgens, met behulp van een wegwerpbiopsieslomp van twee millimeter, ronde huidstukken van volledige dikte weg om korstweefsels te genereren, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus-spier tot aan de opperhuid. Voeg 200 microliter vers DMEM F-12 compleet medium zonder fenolrood toe aan elke put van een 96-well plaat. Breng met behulp van een steriele tang individueel schurftweefsel ondersteboven over naar de putten van een 96-wells plaat.Breng de plaat over naar een celkweekincubator die onder standaardomstandigheden wordt onderhouden. Verwijder op dag twee en vier van de kweek het medium en laat 10 microliter achter in de put en voeg vers voorverwarmd DMEM F-12 compleet medium toe, samen met de behandelingsverbindingen om de levensvatbaarheid van cellen en weefsels te behouden. Voor live beeldvorming van SCADs bereidt u 30 milliliter van 2 tot 3% laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een glazen fles door te verwarmen in een magnetron.Breng na het koken onmiddellijk de fles over en koel de vloeibare agarose-oplossing af in een waterbad van 40 graden Celsius. Breng vervolgens het SCAD-weefsel met fascia of litteken naar boven gericht over op het midden van een schotel van 35 millimeter. Sluit de SCAD vervolgens bij kamertemperatuur in door langzaam 40 graden Celsius vloeibare agarose op het weefsel te gieten met behulp van een pipetpunt van 1000 microliter.Agarose polymeriseert binnen twee minuten. Voeg na polymerisatie twee milliliter voorverwarmd DMEM F-12 compleet medium toe. Vervolgens met behulp van een confocale of een multifotonenmicroscoop uitgerust met geschikte incubatiesystemen die in het manuscript worden uitgelegd, verwerf time-lapse-beelden van dag nul tot dag één.Voor het oogsten van weefsel, was de weefsels op relevante tijdstippen door de media te vervangen door steriel PBS. Breng met behulp van een steriele tang elke SCAD over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 500 microliter 2% paraformaldehyde om de weefsels 's nachts bij vier graden Celsius te fixeren. Was de volgende dag de weefsels drie keer met PBS voordat u overgaat tot twee- of driedimensionale immunofluorescentiekleuring zoals beschreven in het tekstmanuscript.De representatieve whole-mount bright-field beelden van SCADs op dag nul en vijf worden hier getoond. De trichrome kleuring van verticale weefselsecties van de Masson onthult handtekeningen van weefsellittekens, weefselcontractie en accumulatie van extracellulaire matrix in de littekenkern op dagen nul en vijf. De immunofluorescentiekleuring van SCADs op dag nul en vijf wordt getoond.Vanaf het vroege en late stadium van litteken wordt de ingesleten positieve fibroblast weergegeven in groen en de ingesleten negatieve fibroblast in rood. Voor driedimensionale beeldvorming werden weefsels ingebed in agarose-oplossing en bedekt met PBSGT. De representatieve beelden tonen de exclusieve lokalisatie van N-cadherine-eiwit op de littekenplaats van een SCAD van dag vijf.De driedimensionale timelapse beeldvormingsopstelling uitgerust met een incubatiekamer vertoonde vroege gebeurtenissen van progressie van de fibroblastzwermen gedurende de eerste 12 uur of vroege stadia van littekenontwikkeling. De grafische weergave van eencellige gevolgde cellulaire trajecten van individuele fibroblasten over littekenontwikkeling wordt hier gepresenteerd. Het is cruciaal om het SCAD-weefsel ondersteboven in de putplaat te plaatsen, zodat de fascia naar boven is gericht.Als dit niet gebeurt, zou dit leiden tot onvermijdelijke variaties in migratiepatronen. Deze procedure maakt het mogelijk om dermale lagen te onderzoeken voor behandelingen of cultuur met behulp van chemische modulatoren, neutraliserende antilichamen of virale methoden. Dit helpt bij de beoordeling van pathologische fibrotische reacties in verschillende medische omgevingen.We toonden de expressie van connexine-43 en N-cadherine als sleutelmoleculen die betrokken zijn bij fasciamobilisatie bij verwonding. De SCAD-methodologie maakt het mogelijk om nieuwe therapeutische strategieën te identificeren om littekens en fibrose te beperken.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Titratie van de Mens Coronavirussen Met behulp van een immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Een In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Beoordelende vasculaire Hyperpermeability-inducerende stoffen in de huid met de Miles-test

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...