Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
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Nous remercions tous les co-auteurs de Jiang et al. 2020 pour avoir contribué au développement de la méthodologie SCAD13. Nous remercions le Dr Steffen Dietzel et l’installation centrale de bioimagerie de la Ludwig-Maximilans-Universität pour leur accès au système Multiphoton. Y.R. a été soutenu par la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), la subvention Consolidator du Conseil européen de la recherche (ERC-CoG 819933) et la Fondation LEO (LF-OC-21-000835).

Le modèle présenté ci-dessous fournit une description détaillée étape par étape de la génération du test SCAD, comme décrit brièvement dans Jiang et al., 202013. Les préparations d’échantillons SCAD ont été effectuées après avoir sacrifié les animaux conformément aux directives internationales et gouvernementales de Haute-Bavière. Les animaux étaient hébergés dans les animaleries du Centre Helmholtz de Munich. Les pièces ont été entretenues avec une humidité optimale e...

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	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Plusieurs modèles ont déjà été développés pour comprendre la formation de cicatrices après une blessure. Bien que de nombreux progrès aient été réalisés à cet égard, les mécanismes réels ne sont toujours pas clairs. Contrairement à la technique précédente, le modèle SCAD intègre tous les types de cellules et les couches cutanées, maintenant ainsi la complexité de la peau native18,19. Cette méthodologie est capable de générer des ensembl...

La cicatrisation des plaies est un processus de restauration des plaies brisées. Les lésions tissulaires chez les invertébrés entraînent une régénération partielle ou complète. En revanche, les mammifères réagissent aux blessures profondes par la cicatrisation, un processus conçu pour sceller rapidement les plaies avec des bouchons denses de fibres matricielles qui minimisent la zone percée et déforment en même temps de manière permanente le site blessé 1,2,3. Les grandes brûlures cutanées ou les plaies profondes chez les mammifères entraînent des phénotypes pathologiques tels que des cicatrices hypertrophiques ou chéloïdes 4,5. Ces cicatrices exubérantes causent un fardeau énorme sur les systèmes de santé cliniques et mondiaux. Rien qu’aux États-Unis, la gestion des cicatrices coûte environ 10 milliards de dollars par an 6,7. Par conséquent, le développement de méthodologies pertinentes est nécessaire pour mieux comprendre les processus et mécanismes fondamentaux impliqués dans la formation des cicatrices.
Au cours des dernières années, un large éventail d’études chez la souris a révélé des populations hétérogènes de fibroblastes avec des puissances fonctionnelles distinctes en fonction de leurs origines dans certains emplacements de la peau 8,9,10. Dans la peau du dos, Rinkevich et al., 2015, ont identifié qu’une population spécifique de fibroblastes avec une expression embryonnaire précoce d’Engrailed-1 (En1), appelée EPF (Fibroblaste positif engrailed) contribue à la cicatrisation cutanée lors de la blessure. Inversement, une autre lignée de fibroblastes sans antécédents d’expression engrailed, engrailed negative fibroblast (ENF), ne contribue pas à la formation decicatrices 8. La cartographie du destin de ces lignées En1 à l’aide de lignées de souris transgéniques à cre croisées avec des lignées de souris rapporteures de fluorescence telles que R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) permet de visualiser les populations EPF et ENF.
L’étude de la migration des fibroblastes in vivo sur plusieurs jours est limitée par des contraintes éthiques et techniques. En outre, les criblages de bibliothèque d’anticorps composés, viraux et neutralisants pour moduler les voies impliquées dans la cicatrisation sont techniquement difficiles. Les modèles in vitro ou ex vivo précédemment utilisés n’ont pas la capacité de visualiser la migration des fibroblastes et la formation de cicatrices dans des microenvironnements cutanés authentiques, l’uniformité dans le développement des cicatrices, ainsi que la complexité tissulaire qui émule les environnements cutanés in vivo 11,12. Pour surmonter les limites ci-dessus, nous avons développé un test de cicatrisation ex vivo appelé SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Ce test simple peut être effectué en excisant une peau pleine épaisseur de 2 mm contenant l’épiderme, le derme et les régions sous-cutanées du fascia et en les cultivant dans un milieu de DMSO supplémenté en sérum pendant 5 jours. Les cicatrices générées par SCAD reproduisent de manière fiable les caractéristiques transcriptomiques et protéomiques des cicatrices in vivo. De plus, les SCAD générés à partir de lignées de souris transgéniques pertinentes (par exemple, des souris En1) croisées avec des lignées de souris rapporteures fluorescentes permettent de visualiser la dynamique de migration des fibroblastes et le développement de cicatrices à une résolution sans précédent. De plus, ce modèle peut être facilement adapté à toutes les applications à haut débit (p. ex., bibliothèque de composés, bibliothèque d’anticorps ou dépistage viral)13,14. Dans cet article, nous décrivons un protocole optimisé pour générer des SCAD et des applications de traitement en aval ultérieures pour étudier la dynamique cellulaire et matricielle dans le développement des cicatrices.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

La réponse globale des mammifères à l’étanchéité des plaies des tissus profonds se fait par la formation de cicatrices et la contraction des tissus, médiées par des fibroblastes de fascia spécialisés. Malgré l’importance clinique de la formation de cicatrices et de la cicatrisation altérée des plaies, notre compréhension de la dynamique des fibroblastes du fascia dans la cicatrisation des plaies est superficielle en raison du manque de tests pertinents permettant une visualisation directe de la chorégraphie et de la dynamique des fibroblastes dans des environnements complexes tels que les plaies cutanées. Cet article présente un protocole pour générer des cicatrices cutanées ex situ à l’aide de SCAD ou « SCar-like tissue in A Dish » qui émulent l’environnement complexe des plaies cutanées. Dans ce test, une peau pleine épaisseur de 2 mm est excisée et cultivée à l’envers dans un milieu pendant 5 jours, au cours desquels les cicatrices et les contractures cutanées se développent uniformément. Cette méthodologie, associée à des modèles murins transgéniques spécifiques à la lignée des fibroblastes, permet de visualiser les lignées de fibroblastes individuelles tout au long du processus de réparation des plaies. Dans l’ensemble, ce protocole aide les chercheurs à comprendre les processus fondamentaux et les mécanismes de réparation des plaies, en explorant directement les effets des modulateurs sur les résultats de la cicatrisation des plaies.

La génération de SCAD peut être séparée en trois étapes essentielles: la récolte de la peau de souris P0-P1, la génération de poinçons de biopsie de pleine épaisseur et la culture ultérieure de scads individuels jusqu’à 5 jours dans des plaques de 96 puits. En tant que lecture, ce test peut en outre être appliqué pour analyser les aspects spatiaux et temporels de la cicatrisation. L’analyse spatiale utilise le marquage immunitaire 2D et 3D des tissus pour étudier la localisation spatiale des composant...

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Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Ce protocole décrit la génération d’une explantation de fascia de peau appelée « tissu semblable à un SCar dans un plat » ou SCAD. Ce modèle permet une visualisation sans précédent de fibroblastes uniques lors de la formation de cicatrices.

Visualisation du développement des cicatrices à l’aide du test SCAD - Un test de cicatrisation cutanée ex situ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Les modèles in vitro ou ex vivo précédemment utilisés manquent de composants cellulaires dermiques et de complexité du tissu cutané. Ce test SCAD ex situ surmonte une limitation définie et permet d’étudier le développement de cicatrices en dehors de l’animal blessé. Le test SCAD permet de visualiser la migration des fibroblastes et la formation de cicatrices dans les microenvironnements cutanés.Il permet aux bibliothèques de dépistage d’activateurs ou d’inhibiteurs de comprendre la base mécaniste de la formation de cicatrices. Tests de criblage à haut débit de bibliothèques plates utilisant le modèle SCAD pour comprendre le processus fondamental et le cours moléculaire impliqué dans la réparation des plaies. Le test SCAD est facile à effectuer en utilisant les explants cutanés.Pour une cicatrice constante, il est recommandé de sélectionner la peau postnatale jour zéro ou jour un. Après avoir sacrifié le bébé nouveau-né du jour zéro postnatal ou le premier jour, utilisez un scalpel chirurgical stérile pour exciser soigneusement la peau dorsale de 1,5 par 1,5 centimètre d’épaisseur jusqu’à la couche musculaire squelettique. Pelez la peau à l’aide de pinces incurvées stériles, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent.Laver le tissu excisé avec 50 à 100 millilitres de milieu DMEM F-12 froid pour éliminer le sang contaminant. Ensuite, lavez le tissu avec une solution saline équilibrée Hanks pour maintenir la viabilité des tissus et des cellules. Placez la peau à l’envers avec un fascia superficiel sur le dessus dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant du milieu DMEM F-12.Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie jetable de deux millimètres, éliminez les morceaux de peau ronds de pleine épaisseur pour générer des tissus croûtés, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent jusqu’à l’épiderme. Ajouter 200 microlitres de milieu complet DMEM F-12 frais sans rouge phénolique dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. À l’aide de pinces stériles, transférez et immergez complètement le tissu croûté individuel à l’envers jusqu’aux puits d’une plaque de 96 puits.Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire maintenu dans des conditions standard. Les deuxième et quatrième jours de culture, retirez le milieu en laissant 10 microlitres dans le puits et ajoutez le milieu complet DMEM F-12 préchauffé frais ainsi que les composés de traitement pour maintenir les conditions de viabilité cellulaire et tissulaire continues. Pour l’imagerie en direct des SCAD, préparer 30 millilitres de solution d’agarose à faible fusion de 2 à 3% dans du PBS dans une bouteille en verre en chauffant au micro-ondes.Après ébullition, transférer immédiatement la bouteille et refroidir la solution d’agarose liquide dans un bain-marie à 40 degrés Celsius. Ensuite, transférez le tissu SCAD avec le fascia ou la cicatrice vers le haut sur le centre d’un plat de 35 millimètres. Ensuite, incorporez le SCAD à température ambiante en versant lentement de l’agarose liquide de 40 degrés Celsius sur le tissu à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 microlitres.L’agarose polymérise en deux minutes. Après polymérisation, ajouter deux millilitres de milieu complet DMEM F-12 préchauffé. Ensuite, à l’aide d’un microscope confocal ou multiphotonique équipé de systèmes d’incubation appropriés expliqués dans le manuscrit, acquérez des images time-lapse du jour zéro au premier jour.Pour la récolte des tissus, lavez les tissus aux moments pertinents en remplaçant le milieu par du PBS stérile. À l’aide de pinces stériles, transférer chaque SCAD dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2% pour fixer les tissus pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les tissus trois fois avec du PBS avant de procéder à une coloration par immunofluorescence bidimensionnelle ou tridimensionnelle comme décrit dans le manuscrit du texte.Les images représentatives en champ lumineux en montage entier des SCAD les jours zéro et cinq sont présentées ici. La coloration trichrome des sections tissulaires verticales du Masson révèle des signatures de cicatrices tissulaires, de contraction tissulaire et d’accumulation de matrice extracellulaire au cœur de la cicatrice aux jours zéro et cinq. La coloration par immunofluorescence des SCAD aux jours zéro et cinq est montrée.À partir de la cicatrice précoce et tardive, le fibroblaste positif enraciné est représenté en vert et le fibroblaste négatif enraciné en rouge. Pour l’imagerie tridimensionnelle, les tissus ont été incorporés dans une solution d’agarose et surmontés de PBSGT. Les images représentatives démontrent la localisation exclusive de la protéine N-cadhérine sur le site cicatriciel d’un SCAD du cinquième jour.La configuration d’imagerie en accéléré tridimensionnelle équipée d’une chambre d’incubation a montré les premiers événements de progression des essaims de fibroblastes au cours des 12 premières heures ou des premiers stades du développement de la cicatrice. La représentation graphique des trajectoires cellulaires unicellulaires suivies de fibroblastes individuels sur le développement de cicatrices est présentée ici. Il est crucial de placer le tissu SCAD à l’envers à l’intérieur de la plaque du puits afin que le fascia soit orienté vers le haut.Ne pas le faire entraînerait des variations inévitables dans les schémas de migration. Cette procédure permet d’examiner les couches cutanées pour des traitements ou une culture à l’aide de modulateurs chimiques, d’anticorps neutralisants ou de méthodes virales. Cela aide à l’évaluation des réponses fibrotiques pathologiques dans divers contextes médicaux.Nous avons montré l’expression de la connexine-43 et de la N-cadhérine en tant que molécules clés impliquées dans la mobilisation du fascia lors de la blessure. La méthodologie SCAD permet d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour réduire les cicatrices et la fibrose.

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