Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
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Wir danken allen Co-Autoren von Jiang et al. 2020 für ihren Beitrag zur Entwicklung der SCAD-Methodik13. Wir danken Dr. Steffen Dietzel und der Bioimaging Core Facility der Ludwig-Maximilans-Universität für den Zugang zum Multiphotonensystem. Y.R. wurde gefördert durch die Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), den European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) und die LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Das unten vorgestellte Modell bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Generierung des SCAD-Assays, wie in Jiang et al., 202013, kurz beschrieben. SCAD-Probenvorbereitungen wurden nach der Opferung der Tiere gemäß den internationalen und der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Tiere wurden in der Tieranlage des Helmholtz-Zentrums München untergebracht. Die Räume wurden mit optimaler Luftfeuchtigkeit und konstanter Temperatur mit einem Lichtzyklus von 12 h gepflegt. Di...

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L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Mehrere Modelle wurden bereits entwickelt, um die Narbenbildung nach Verletzungen zu verstehen. Während in dieser Hinsicht viele Fortschritte erzielt wurden, sind die tatsächlichen Mechanismen noch nicht klar. Im Gegensatz zur bisherigen Technik bezieht das SCAD-Modell alle Zelltypen und Hautschichten mit ein, wodurch die Komplexität der nativen Haut18,19 erhalten bleibt. Diese Methodik ist in der Lage, grundlegende Datensätze zu generieren, die für das Vers...

Wundheilung ist ein Prozess der Wiederherstellung von gebrochenen Wunden. Gewebeverletzungen bei Wirbellosen führen zu einer teilweisen oder vollständigen Regeneration. Im Gegensatz dazu reagieren Säugetiere auf tiefe Verletzungen durch Narbenbildung, ein Prozess, der darauf zugeschnitten ist, Wunden schnell mit dichten Pfropfen aus Matrixfasern zu versiegeln, die den durchbrochenen Bereich minimieren und gleichzeitig die verletzte Stelle dauerhaft verformen 1,2,3. Große Hautverbrennungen oder tiefe offene Wunden bei Säugetieren führen zu pathologischen Phänotypen wie hypertrophen oder keloiden Narben 4,5. Diese überschwänglichen Narben verursachen eine enorme Belastung für die klinischen und globalen Gesundheitssysteme. Allein in den USA kostet das Narbenmanagement jährlichetwa 10 Milliarden US-Dollar 6,7. Daher ist die Entwicklung relevanter Methoden erforderlich, um die grundlegenden Prozesse und Mechanismen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, besser zu verstehen.
In den letzten Jahren hat eine breite Palette von Studien an Mäusen heterogene Fibroblastenpopulationen mit unterschiedlichen funktionellen Potenzen basierend auf ihrer Herkunft an bestimmten Hautstellengezeigt 8,9,10. In der Rückenhaut identifizierten Rinkevich et al., 2015, dass eine spezifische Fibroblastenpopulation mit einer frühen embryonalen Expression von Engrailed-1 (En1), genannt EPF (Engrailed positive Fibroblast), zur kutanen Narbenbildung bei der Wunde beiträgt. Umgekehrt trägt eine andere Fibroblastenlinie ohne Geschichte der engrailed expression, Engrailed negative fibroblast (ENF), nicht zur Narbenbildungbei 8. Die Schicksalskartierung dieser En1-Linien unter Verwendung von Cre-gesteuerten transgenen Mauslinien, die zu Fluoreszenzreporter-Mauslinien wie R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gekreuzt wurden, ermöglicht die Visualisierung von EPF- und ENF-Populationen.
Die Untersuchung der Fibroblastenmigration in vivo über mehrere Tage ist durch ethische und technische Einschränkungen begrenzt. Darüber hinaus sind zusammengesetzte, virale und neutralisierende Antikörperbibliotheks-Screens zur Modulation von Signalwegen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, technisch eine Herausforderung. Zuvor verwendete In-vitro- oder Ex-vivo-Modelle sind nicht in der Lage, die Migration von Fibroblasten und die Narbenbildung in echten Hautmikroumgebungen, die Gleichmäßigkeit der Narbenentwicklung sowie die Gewebekomplexität, die in vivo-Hautumgebungen emuliert, zu visualisieren 11,12. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Ex-vivo-Narbenuntersuchungsassay namens SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14 entwickelt. Dieser einfache Assay kann durchgeführt werden, indem 2 mm dicke Haut, die die Epidermis, die Dermis und die subkutanen Faszienregionen enthält, entfernt und in serumergänzten DMSO-Medien für bis zu 5 Tage kultiviert werden. Narben, die durch SCAD erzeugt werden, replizieren zuverlässig transkriptomische und proteomische Merkmale von In-vivo-Narben. Darüber hinaus ermöglichen SCADs, die aus relevanten transgenen Mauslinien (z. B. En1-Mäusen) erzeugt werden, die mit fluoreszierenden Reporter-Mauslinien gekreuzt sind, die Visualisierung der Migrationsdynamik und Narbenentwicklung von Fibroblasten mit einer beispiellosen Auflösung. Darüber hinaus kann dieses Modell leicht an alle Anwendungen mit hohem Durchsatz angepasst werden (z. B. Substanzbibliothek, Antikörperbibliothek oder virales Screening)13,14. In diesem Artikel beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SCADs und nachgelagerten Verarbeitungsanwendungen zur Untersuchung der Zell- und Matrixdynamik bei der Narbenentwicklung.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

Die globale Reaktion von Säugetieren auf die Versiegelung tiefer Gewebewunden erfolgt durch Narbenbildung und Gewebekontraktion, vermittelt durch spezialisierte Faszienfibroblasten. Trotz der klinischen Bedeutung der Narbenbildung und der gestörten Wundheilung ist unser Verständnis der Faszienfibroblastendynamik in der Wundheilung aufgrund des Fehlens relevanter Assays, die eine direkte Visualisierung der Fibroblastenchoreografie und -dynamik in komplexen Umgebungen wie in Hautwunden ermöglichen, oberflächlich. Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Erzeugung von Ex-situ-Hautnarben mit SCAD oder "SCar-ähnlichem Gewebe in A Dish" vor, die die komplexe Umgebung von Hautwunden nachahmen. Bei diesem Assay wird 2 mm dicke Haut 5 Tage lang in Medien ausgeschnitten und auf den Kopf gestellt, wobei sich Narben und Hautkontrakturen gleichmäßig entwickeln. Diese Methodik, gepaart mit fibroblastenlinienspezifischen transgenen Mausmodellen, ermöglicht die Visualisierung einzelner Fibroblastenlinien über den gesamten Wundreparaturprozess hinweg. Insgesamt hilft dieses Protokoll den Forschern, grundlegende Prozesse und Mechanismen der Wundreparatur zu verstehen und die Auswirkungen von Modulatoren auf die Wundheilungsergebnisse direkt zu untersuchen.

Die Generierung von SCADs kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden: Ernte der Rückenhaut von P0-P1-Mäusen, Erzeugung von Biopsiestempeln in voller Dicke und anschließende Kultur einzelner Scads bis zu 5 Tage in 96-Well-Platten. Als Auslesung kann dieser Assay weiter angewendet werden, um die räumlichen und zeitlichen Aspekte der Narbenbildung zu analysieren. Die räumliche Analyse verwendet 2D- und 3D-Immunmarkierung von Geweben, um die räumliche Lokalisation von Zell- und Matrixkomponenten innerhalb des ...

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Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines Haut-Faszien-Explantats, das als "SCar-ähnliches Gewebe in einer Schale" oder SCAD bezeichnet wird. Dieses Modell ermöglicht eine beispiellose Visualisierung einzelner Fibroblasten während der Narbenbildung.

Visualisierung der Narbenentwicklung mit SCAD Assay - einem Ex-situ Hautnarbentest

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Zuvor verwendeten In-vitro- oder Ex-vivo-Modellen fehlen dermale Zellbestandteile und Komplexität des Hautgewebes. Dieser Ex-situ-SCAD-Assay überwindet eine festgelegte Einschränkung und ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung von Narben außerhalb des verwundeten Tieres. Der SCAD-Assay ermöglicht die Visualisierung der Migration von Fibroblasten und der Narbenbildung in Mikroumgebungen der Haut.Es ermöglicht Screening-Bibliotheken von Aktivatoren oder Inhibitoren, die mechanistischen Grundlagen der Narbenbildung zu verstehen. Hochdurchsatz-Screening-Assays von flachen Bibliotheken unter Verwendung des SCAD-Modells zum Verständnis des grundlegenden Prozesses und des Molekülverlaufs, der an der Wundreparatur beteiligt ist. Der SCAD-Assay ist mit den Hautexplantaten einfach durchzuführen.Für eine konsistente Narbe wird empfohlen, die Haut nach der Geburt am Tag Null oder am ersten Tag auszuwählen. Nachdem Sie den postnatalen Tag Null oder den ersten Tag eines neugeborenen Welpen geopfert haben, verwenden Sie ein steriles chirurgisches Skalpell, um vorsichtig 1,5 x 1,5 Zentimeter große Rückenhaut in voller Dicke bis zur Skelettmuskelschicht zu entfernen. Schälen Sie die Haut mit sterilen gekrümmten Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus intakt ist.Waschen Sie das ausgeschnittene Gewebe mit 50 bis 100 Millilitern kaltem DMEM F-12-Medium, um kontaminierendes Blut zu entfernen. Waschen Sie dann das Gewebe mit Hanks ausgewogener Salzlösung, um die Lebensfähigkeit von Gewebe und Zellen zu erhalten. Legen Sie die Haut kopfüber mit oberflächlicher Faszie in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit DMEM F-12 Medium.Schneiden Sie dann mit einem Einweg-Zwei-Millimeter-Biopsiestempel runde Hautstücke in voller Dicke aus, um Schorfgewebe zu erzeugen, und stellen Sie sicher, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus bis zur Epidermis intakt ist. Fügen Sie 200 Mikroliter frisches DMEM F-12-Komplettmedium ohne Phenolrot in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu. Mit sterilen Pinzetten können Sie einzelnes Schorfgewebe kopfüber in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte übertragen und vollständig eintauchen.Überführen Sie die Platte in einen Zellkulturinkubator, der unter Standardbedingungen gewartet wird. Entfernen Sie an den Tagen zwei und vier der Kultur das Medium, das 10 Mikroliter im Bohrloch verbleibt, und fügen Sie frisches, vorgewärmtes DMEM F-12-Komplettmedium zusammen mit den Behandlungsverbindungen hinzu, um die Lebensfähigkeit von Zellen und Geweben aufrechtzuerhalten. Für die Live-Bildgebung von SCADs bereiten Sie 30 Milliliter 2 bis 3% niedrig schmelzende Agaroselösung in PBS in einer Glasflasche durch Erhitzen in einer Mikrowelle vor.Nach dem Kochen sofort die Flasche umfüllen und die flüssige Agaroselösung in einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad abkühlen. Als nächstes übertragen Sie das SCAD-Gewebe mit Faszien oder Narben, die nach oben zeigen, auf die Mitte einer 35-Millimeter-Schale. Dann betten Sie den SCAD bei Raumtemperatur ein, indem Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze langsam 40 Grad Celsius flüssige Agarose auf das Gewebe gießen.Agarose polymerisiert innerhalb von zwei Minuten. Nach der Polymerisation zwei Milliliter vorgewärmtes DMEM F-12 Vollmedium hinzufügen. Erfassen Sie dann mit einem konfokalen oder einem Multiphotonenmikroskop, das mit geeigneten Inkubationssystemen ausgestattet ist, die im Manuskript erläutert werden, Zeitrafferbilder vom Tag Null bis zum ersten Tag.Für die Gewebeentnahme waschen Sie das Gewebe zu relevanten Zeitpunkten, indem Sie die Medien durch steriles PBS ersetzen. Übertragen Sie jede SCAD mit steriler Pinzette auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter 2% Paraformaldehyd enthält, um das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius zu fixieren. Waschen Sie am nächsten Tag das Gewebe dreimal mit PBS, bevor Sie mit der zwei- oder dreidimensionalen Immunfluoreszenzfärbung fortfahren, wie im Textmanuskript beschrieben.Hier werden die repräsentativen Ganzfeld-Hellfeldbilder von SCADs an den Tagen Null und fünf gezeigt. Die trichrome Färbung der vertikalen Gewebeabschnitte des Masson zeigt Signaturen von Gewebenarbenbildung, Gewebekontraktion und Akkumulation von extrazellulärer Matrix am Narbenkern an den Tagen Null und Fünf. Die Immunfluoreszenzfärbung von SCADs an den Tagen Null und fünf wird gezeigt.Von der Narbe im Früh- und Spätstadium wird der tief verwurzelte positive Fibroblast in Grün und der tief verwurzelte negative Fibroblast in Rot dargestellt. Für die dreidimensionale Bildgebung wurden Gewebe in Agaroselösung eingebettet und mit PBSGT überzogen. Die repräsentativen Bilder zeigen die exklusive Lokalisierung des N-Cadherin-Proteins an der Narbenstelle eines SCAD am fünften Tag.Der dreidimensionale Zeitraffer-Bildgebungsaufbau, der mit einer Inkubationskammer ausgestattet war, zeigte frühe Ereignisse des Fortschreitens der Fibroblastenschwärme in den ersten 12 Stunden oder frühe Stadien der Narbenentwicklung. Die grafische Darstellung von einzellig verfolgten zellulären Trajektorien einzelner Fibroblasten über die Narbenentwicklung wird hier vorgestellt. Es ist wichtig, das SCAD-Gewebe verkehrt herum in der Bohrlochplatte zu platzieren, so dass die Faszie nach oben zeigt.Würde dies nicht geschehen, würde dies zu unvermeidlichen Schwankungen der Migrationsmuster führen. Dieses Verfahren ermöglicht es, dermale Schichten für Behandlungen oder Kultur mit chemischen Modulatoren, neutralisierenden Antikörpern oder viralen Methoden zu untersuchen. Dies hilft bei der Beurteilung pathologischer fibrotischer Reaktionen in verschiedenen medizinischen Umgebungen.Wir zeigten die Expression von Connexin-43 und N-Cadherin als Schlüsselmoleküle, die an der Faszienmobilisation bei der Wunde beteiligt sind. Die SCAD-Methodik ermöglicht die Identifizierung neuartiger therapeutischer Strategien zur Eindämmung von Narbenbildung und Fibrose.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

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Forschung

Biologie

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