Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Riconosciamo tutti i co-autori di Jiang et al. 2020 per aver contribuito allo sviluppo della metodologia SCAD13. Ringraziamo il Dr. Steffen Dietzel e la struttura centrale di Bioimaging presso la Ludwig-Maximilans-Universität per l'accesso al sistema Multiphoton. Y.R. è stato sostenuto dalla Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), dall'European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) e dalla LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Il modello presentato di seguito fornisce una descrizione dettagliata passo-passo della generazione del test SCAD come brevemente descritto in Jiang et al., 202013. I preparati dei campioni SCAD sono stati eseguiti dopo aver sacrificato gli animali secondo le linee guida internazionali e del governo dell'Alta Baviera. Gli animali erano ospitati presso la struttura per animali del Centro Helmholtz di Monaco. Le camere sono state mantenute con umidità ottimale e temperatura costante con un ciclo di...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Diversi modelli sono già stati sviluppati per comprendere la formazione di cicatrici dopo l'infortunio. Mentre molti progressi sono stati fatti in questo senso, ma i meccanismi effettivi non sono ancora chiari. In contrasto con la tecnica precedente, il modello SCAD incorpora tutti i tipi di cellule e gli strati cutanei, mantenendo così la complessità della pelle nativa18,19. Questa metodologia è in grado di generare set di dati fondamentali che sono importan...

La guarigione delle ferite è un processo di ripristino delle ferite violate. Le lesioni tissutali negli invertebrati provocano una rigenerazione parziale o completa. Al contrario, i mammiferi rispondono alle lesioni profonde con cicatrici, un processo su misura per sigillare rapidamente le ferite con densi tappi di fibre matriciali che riducono al minimo l'area violata e allo stesso tempo deformano permanentemente il sito ferito 1,2,3. Grandi ustioni cutanee o profonde ferite aperte nei mammiferi provocano fenotipi patologici come cicatrici ipertrofiche o cheloidi 4,5. Queste cicatrici esuberanti causano un enorme onere per i sistemi sanitari clinici e globali. Solo negli Stati Uniti, la gestione delle cicatrici costa circa $ 10 miliardi all'anno 6,7. Pertanto, è necessario lo sviluppo di metodologie pertinenti per comprendere meglio i processi e i meccanismi fundementali coinvolti nella formazione delle cicatrici.
Negli ultimi anni, una vasta gamma di studi sui topi ha rivelato popolazioni eterogenee di fibroblasti con potenze funzionali distinte in base alle loro origini in determinate località cutanee 8,9,10. Nella pelle della schiena, Rinkevich et al., 2015, hanno identificato che una specifica popolazione di fibroblasti con un'espressione embrionale precoce di Engrailed-1 (En1), chiamata EPF (engrailed positive fibroblast) contribuisce alle cicatrici cutanee sulla ferita. Al contrario, un altro lignaggio di fibroblasti senza storia di espressione engrailed, Engrailed negative fibroblast (ENF), non contribuisce alla formazione di cicatrici8. La mappatura del destino di questi lignaggi En1 utilizzando linee di topo transgenico guidate da Cre incrociate a linee di topo reporter a fluorescenza come R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) consente la visualizzazione delle popolazioni EPF ed ENF.
Lo studio della migrazione dei fibroblasti in vivo per diversi giorni è limitato da vincoli etici e tecnici. Inoltre, gli screening della libreria di anticorpi composti, virali e neutralizzanti per modulare i percorsi coinvolti nelle cicatrici sono tecnicamente impegnativi. I modelli precedentemente utilizzati in vitro o ex vivo non hanno la capacità di visualizzare la migrazione dei fibroblasti e la formazione di cicatrici in microambienti cutanei autentici, l'uniformità nello sviluppo delle cicatrici e la complessità dei tessuti che emula gli ambienti cutanei in vivo 11,12. Per superare le limitazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato un saggio di cicatrici ex vivo chiamato SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Questo semplice test può essere eseguito asportando la pelle a tutto spessore di 2 mm contenente l'epidermide, il derma e le regioni della fascia sottocutanea e coltivandole in mezzi DMSO integrati con siero per un massimo di 5 giorni. Le cicatrici generate da SCAD replicano in modo affidabile i segni trascrittomici e proteomici delle cicatrici in vivo. Inoltre, gli SCAD generati da linee di topo transgeniche rilevanti (ad esempio, topi En1) incrociati con linee di topo reporter fluorescenti consentono la visualizzazione delle dinamiche di migrazione dei fibroblasti e lo sviluppo di cicatrici a una risoluzione senza precedenti. Inoltre, questo modello può essere facilmente adattato per qualsiasi applicazione ad alto rendimento (ad esempio, libreria di composti, libreria di anticorpi o screening virale)13,14. In questo articolo, descriviamo un protocollo ottimizzato per generare SCAD e successive applicazioni di elaborazione a valle per studiare le dinamiche cellulari e matriciali nello sviluppo di cicatrici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

La risposta globale dei mammiferi alla sigillatura delle ferite dei tessuti profondi è attraverso la formazione di cicatrici e la contrazione dei tessuti, mediata da fibroblasti della fascia specializzati. Nonostante il significato clinico della formazione di cicatrici e della compromissione della guarigione delle ferite, la nostra comprensione delle dinamiche dei fibroblasti della fascia nella guarigione delle ferite è superficiale a causa della mancanza di saggi pertinenti che consentano la visualizzazione diretta della coreografia e della dinamica dei fibroblasti in ambienti complessi come le ferite cutanee. Questo documento presenta un protocollo per generare cicatrici cutanee ex-situ utilizzando SCAD o "tessuto simile a SCar in A Dish" che emulano il complesso ambiente delle ferite cutanee. In questo test, la pelle a tutto spessore di 2 mm viene asportata e coltivata a testa in giù nei mezzi per 5 giorni, durante i quali cicatrici e contratture cutanee si sviluppano uniformemente. Questa metodologia, abbinata a modelli murini transgenici specifici per il lignaggio dei fibroblasti, consente la visualizzazione dei singoli lignaggi dei fibroblasti durante l'intero processo di riparazione della ferita. Nel complesso, questo protocollo aiuta i ricercatori a comprendere i processi e i meccanismi fondamentali della riparazione delle ferite, esplorando direttamente gli effetti dei modulatori sui risultati della guarigione delle ferite.

La generazione di SCAD può essere suddivisa in tre passaggi essenziali: raccolta della pelle dai topi P0-P1, generazione di pugni per biopsia a tutto spessore e successiva coltura di singoli scad fino a 5 giorni in piastre a 96 pozzetti. Come lettura, questo test può essere ulteriormente applicato per analizzare gli aspetti spaziali e temporali delle cicatrici. L'analisi spaziale utilizza l'immunodetichettazione 2D e 3D dei tessuti per studiare la localizzazione spaziale dei componenti cellulari e della matrice all'int...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Questo protocollo descrive la generazione di un espianto della fascia cutanea chiamato "SCar like tissue in A Dish" o SCAD. Questo modello consente una visualizzazione senza precedenti di singoli fibroblasti durante la formazione di cicatrici.

Visualizzazione dello sviluppo delle cicatrici utilizzando il test SCAD - Un test di cicatrici cutanee ex-situ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

I modelli precedentemente utilizzati in vitro o ex vivo mancano di componenti delle cellule dermiche e della complessità del tessuto cutaneo. Questo test SCAD ex situ supera una limitazione fissa e consente di studiare lo sviluppo di cicatrici al di fuori dell'animale ferito. Il test SCAD consente la visualizzazione della migrazione dei fibroblasti e della formazione di cicatrici nei microambienti cutanei.Consente alle librerie di screening di attivatori o inibitori di comprendere le basi meccanicistiche della formazione di cicatrici. Saggi di screening ad alto rendimento di librerie piatte utilizzando il modello SCAD per comprendere il processo fondamentale e il corso molecolare coinvolto nella riparazione delle ferite. Il test SCAD è facile da eseguire utilizzando gli espianti cutanei.Per cicatrici consistenti, si consiglia di selezionare la pelle post-natale giorno zero o giorno uno. Dopo aver sacrificato il giorno zero post-natale o il primo giorno del cucciolo appena nato, utilizzare un bisturi chirurgico sterile per asportare con cura la pelle dorsale dorsale a pieno spessore di 1,5 per 1,5 centimetri fino allo strato muscolare scheletrico. Sbucciare la pelle con una pinza curva sterile, assicurandosi che la fascia superficiale sia intatta con il muscolo carnoso pannicolo sottostante.Lavare il tessuto asportato con 50-100 millilitri di mezzo DMEM F-12 freddo per rimuovere il sangue contaminante. Quindi, lavare il tessuto con la soluzione salina bilanciata Hanks per mantenere la vitalità dei tessuti e delle cellule. Posizionare la pelle a testa in giù con la fascia superficiale sulla parte superiore in una capsula di Petri di 10 centimetri contenente DMEM F-12 medio.Quindi, utilizzando un punch bioptico monouso a due millimetri, asportare pezzi di pelle rotonda a tutto spessore per generare tessuti a croste, assicurando che la fascia superficiale sia intatta con il muscolo carnoso pannicolo sottostante fino all'epidermide. Aggiungere 200 microlitri di mezzo completo DMEM F-12 fresco senza rosso fenolo in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Usando una pinza sterile, trasferisci e immergi completamente il singolo tessuto scabbato a testa in giù nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.Trasferire la piastra in un incubatore di colture cellulari mantenuto in condizioni standard. Nei giorni due e quattro di coltura, rimuovere il mezzo lasciando 10 microlitri nel pozzo e aggiungere un mezzo completo DMEM F-12 preriscaldato fresco insieme ai composti di trattamento per mantenere condizioni di vitalità cellulare e tissutale continue. Per l'imaging dal vivo di SCAD, preparare 30 millilitri di soluzione di agarosio a bassa fusione dal 2 al 3% in PBS in una bottiglia di vetro riscaldando in un forno a microonde.Dopo l'ebollizione, trasferire immediatamente la bottiglia e raffreddare la soluzione liquida di agarosio a bagnomaria a 40 gradi Celsius. Quindi, trasferire il tessuto SCAD con fascia o cicatrice rivolta verso l'alto al centro di un piatto da 35 millimetri. Quindi incorporare l'SCAD a temperatura ambiente versando lentamente agarosio liquido a 40 gradi Celsius sul tessuto utilizzando una punta della pipetta da 1000 microliti.L'agarosio polimerizza entro due minuti. Dopo la polimerizzazione, aggiungere due millilitri di mezzo completo DMEM F-12 preriscaldato. Quindi utilizzando un microscopio confocale o multifotonico dotato di idonei sistemi di incubazione spiegati nel manoscritto, acquisire immagini time-lapse dal giorno zero al primo giorno.Per la raccolta dei tessuti, lavare i tessuti nei punti temporali pertinenti sostituendo il supporto con PBS sterile. Utilizzando una pinza sterile, trasferire ogni SCAD in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di paraformaldeide al 2% per fissare i tessuti durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare i tessuti tre volte con PBS prima di procedere alla colorazione immunofluorescenza bidimensionale o tridimensionale come descritto nel manoscritto di testo.Le immagini rappresentative a campo luminoso a montaggio intero degli SCAD nei giorni zero e cinque sono mostrate qui. La colorazione tricroma di Masson delle sezioni di tessuto verticale rivela le firme di cicatrici tissutali, contrazione tissutale e accumulo di matrice extracellulare al centro della cicatrice ai giorni zero e cinque. Viene mostrata la colorazione di immunofluorescenza degli SCAD ai giorni zero e cinque.Dalla cicatrice in fase iniziale e avanzata, il fibroblasto positivo radicato è mostrato in verde e il fibroblasto negativo radicato in rosso. Per l'imaging tridimensionale, i tessuti sono stati incorporati in una soluzione di agarosio e sormontati da PBSGT. Le immagini rappresentative dimostrano la localizzazione esclusiva della proteina N-caderina nel sito cicatriziale di un SCAD del quinto giorno.La configurazione tridimensionale di imaging time lapse dotata di una camera di incubazione ha mostrato i primi eventi di progressione degli sciami di fibroblasti nelle prime 12 ore o nelle prime fasi dello sviluppo della cicatrice. La rappresentazione grafica delle traiettorie cellulari tracciate a singola cellula dei singoli fibroblasti sullo sviluppo della cicatrice è presentata qui. È fondamentale posizionare il tessuto SCAD a testa in giù all'interno della piastra del pozzo in modo che la fascia sia rivolta verso l'alto.In caso contrario, si verificherebbero inevitabili variazioni nei modelli di migrazione. Questa procedura consente di esaminare gli strati dermici per trattamenti o colture utilizzando modulatori chimici, anticorpi neutralizzanti o metodi virali. Questo aiuta nella valutazione delle risposte fibrotiche patologiche in diversi contesti medici.Abbiamo mostrato l'espressione di connexina-43 e N-caderina come molecole chiave coinvolte nella mobilizzazione della fascia al momento della ferita. La metodologia SCAD consente l'identificazione di nuove strategie terapeutiche per ridurre cicatrici e fibrosi.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Titolazione del coronavirus umani utilizzando un test immunoperossidasi

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Ricerca

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L&#39;utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...