Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
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우리는 SCAD 방법론13의 개발에 기여한 Jiang et al. 2020의 모든 공동 저자를 인정합니다. Multiphoton 시스템에 대한 액세스를 위해 Steffen Dietzel 박사와 Ludwig-Maximilans-Universität의 Bioimaging 핵심 시설에 감사드립니다. Y.R.은 Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), ERC-CoG 819933 European Research Council Consolidator Grant 및 LEO Foundation (LF-OC-21-000835)의 지원을 받았습니다.

아래에 제시된 모델은 Jiang et al., 202013에 간략하게 기재된 바와 같이 SCAD 분석의 생성에 대한 상세한 단계별 설명을 제공한다. SCAD 샘플 준비는 국제 및 어퍼 바이에른 정부 지침에 따라 동물을 희생시킨 후에 수행되었다. 동물들은 헬름홀츠 센터 뮌헨의 동물 시설에 수용되었다. 객실은 최적의 습도와 일정한 온도로 12 시간 빛주기로 유지되었습니다. 동물에게 음식 및 광고 리...

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Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

부상 후 흉터 형성을 이해하기 위해 이미 여러 모델이 개발되었습니다. 이와 관련하여 많은 발전이 이루어졌지만 실제 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이전의 기술과는 달리, SCAD 모델은 모든 세포 유형 및 피부 층을 통합하여, 천연 피부(18,19)의 복잡성을 유지한다. 이 방법론은 흉터 형성을 유도하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요한 기본 ?...

상처 치유는 침해 된 상처의 회복 과정입니다. 무척추 동물의 조직 손상은 부분적 또는 완전한 재생을 초래합니다. 대조적으로, 포유류는 흉터에 의한 깊은 부상에 반응하는데, 이는 침범 부위를 최소화 하고 동시에 부상당한 부위 1,2,3을 영구적으로 변형시키는 매트릭스 섬유의 조밀 한 플러그로 상처를 신속하게 봉인하도록 맞춤화 된 과정입니다. 포유류의 큰 피부 화상이나 깊은 열린 상처는 비후성 또는 켈로이드 흉터 4,5와 같은 병리학 적 표현형을 초래합니다. 이러한 풍부한 흉터는 임상 및 글로벌 의료 시스템에 엄청난 부담을 안겨줍니다. 미국에서만 흉터 관리 비용은 연간 약 100 억 달러 6,7입니다. 따라서 흉터 형성과 관련된 기금 과정과 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 관련 방법론의 개발이 필요합니다.
최근 몇 년 동안, 마우스에 대한 광범위한 연구는 특정 피부 위치 8,9,10에서 기원에 따라 뚜렷한 기능적 효능을 가진 이질적인 섬유 아세포 집단을 밝혀 냈습니다. 허리 피부에서, Rinkevich et al., 2015는 EPF (Engrailed positive fibroblast)라고 불리는 Engrailed-1 (En1)의 초기 배아 발현을 가진 특정 섬유 아세포 집단이 상처시 피부 흉터에 기여한다는 것을 확인했습니다. 반대로, 엥레일 발현의 이력이 없는 또 다른 섬유아세포 계통인 Engrailed negative fibroblast (ENF)는 흉터 형성에 기여하지 않는다8. R26 mTmG (En1Cre x R26mTmG)와 같은 형광 리포터 마우스 라인으로 교차된 Cre 구동 트랜스제닉 마우스 라인을 사용하여 이들 En1 계통의 운명 매핑은 EPF 및 ENF 집단의 시각화를 가능하게 한다.
수일에 걸쳐 생체 내에서 섬유아세포 이동을 연구하는 것은 윤리적 및 기술적 제약에 의해 제한된다. 더욱이, 화합물, 바이러스 및 중화 항체 라이브러리 스크린은 흉터에 관여하는 경로를 조절하기 위해 기술적으로 도전적이다. 이전에 사용된 시험관내 또는 생체외 모델은 진정한 피부 미세환경에서의 섬유아세포 이동 및 흉터 형성, 흉터 발달에서의 균일성, 생체내 피부 환경을 에뮬레이트하는 조직 복잡성을 시각화하는 능력이 부족하다(11,12). 상기 한계를 극복하기 위해, 우리는 SCAD (A Dish의 SCar 유사 조직)13,14로 불리는 생체외 흉터 분석 방법을 개발하였다. 이 간단한 분석은 표피, 진피 및 피하 근막 영역을 함유하는 2mm 전두께의 피부를 절제하고 이를 혈청이 보충된 DMSO 배지에서 최대 5일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. SCAD로부터 생성된 흉터는 생체내 흉터의 전사체 및 프로테오믹 특징을 신뢰성 있게 복제한다. 또한, 형광 리포터 마우스 라인과 교차된 관련 트랜스제닉 마우스 라인(예를 들어, En1 마우스)으로부터 생성된 SCADs는 전례 없는 해상도에서 섬유아세포 이동 역학 및 흉터 발달의 시각화를 허용한다. 또한, 이 모델은 임의의 높은 처리량 응용(예를 들어, 화합물 라이브러리, 항체 라이브러리, 또는 바이러스 스크리닝)13,14)에 용이하게 적응될 수 있다. 이 기사에서는 SCAD를 생성하는 최적화된 프로토콜 및 흉터 개발에서 세포 및 매트릭스 역학을 연구하기 위한 후속 다운스트림 처리 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

깊은 조직 상처 밀봉에 대한 포유류의 세계적인 반응은 흉터 형성 및 조직 수축을 통해 이루어지며, 이는 전문화된 근막 섬유아세포에 의해 매개된다. 흉터 형성 및 손상된 상처 치유의 임상 적 중요성에도 불구하고, 상처 치유에서 근막 섬유 아세포 역학에 대한 우리의 이해는 피부 상처와 같은 복잡한 환경에서 섬유 아세포 안무 및 역학의 직접적인 시각화를 가능하게하는 관련 분석이 부족하기 때문에 까다 롭습니다. 이 논문은 피부 상처의 복잡한 환경을 모방하는 SCAD 또는 "접시의 SCar-유사 조직"을 사용하여 ex-situ 피부 흉터를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에서, 2mm 전체 두께의 피부를 적출하고 5 일 동안 배지에서 거꾸로 배양하여 흉터와 피부 수축이 균일하게 발생합니다. 섬유아세포-계보 특이적 트랜스제닉 마우스 모델과 결합된 이 방법론은 전체 상처 복구 과정에 걸쳐 개별 섬유아세포 혈통을 시각화할 수 있게 한다. 전반적으로,이 프로토콜은 연구자가 상처 복구의 기본 과정과 메커니즘을 이해하고 상처 치유 결과에 대한 조절제의 효과를 직접 탐구하는 데 도움을줍니다.

SCAD의 생성은 세 가지 필수 단계로 분리 될 수 있습니다 : P0-P1 마우스에서 피부를 다시 수확하고, 전체 두께 생검 펀치를 생성하고, 96 웰 플레이트에서 최대 5 일까지 개별 스캐드를 배양하십시오. 판독으로서, 이러한 분석은 흉터의 공간적 및 시간적 측면을 분석하기 위해 추가로 적용될 수 있다. 공간 분석은 조직의 2D 및 3D 면역 표지를 사용하여 개발 흉터 조직 내에서 세포 및 매트릭스 구성 요?...

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Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

이 프로토콜은 "A Dish의 조직과 같은 SCar"또는 SCAD라고 불리는 피부 근막 외래 식물의 생성을 설명합니다. 이 모델은 흉터 형성 동안 단일 섬유 아세포의 전례없는 시각화를 허용합니다.

SCAD 분석을 사용한 흉터 발달 시각화 - 전 계내 피부 흉터 분석

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

이전에 사용된 시험관내 또는 생체외 모델은 진피 세포 성분과 피부 조직의 복잡성이 결여되어 있다. 이 전 현장 SCAD 분석은 설정된 한계를 극복하고 상처 입은 동물 외부의 흉터 발달을 연구 할 수있게합니다. SCAD 분석은 피부 미세 환경에서 섬유아세포 이동 및 흉터 형성을 시각화할 수 있게 해줍니다.그것은 활성화제 또는 억제제의 스크리닝 라이브러리가 흉터 형성의 기계론적 기초를 이해할 수있게합니다. SCAD 모델을 사용하여 상처 복구에 관여하는 분자 과정과 기본 과정을 이해하는 편평한 라이브러리의 고처리량 스크리닝 분석. SCAD 분석은 피부 외식편을 사용하여 수행하기 쉽습니다.일관된 흉터를 얻으려면 출생 후 제로 또는 하루 한 피부를 선택하는 것이 좋습니다. 출생 후 0 일 또는 신생아 새끼를 희생 한 후 멸균 외과 용 메스를 사용하여 골격근층까지 1.5 x 1.5 센티미터의 전체 두께의 등쪽 등 피부를 조심스럽게 소비하십시오. 멸균 곡선 포셉을 사용하여 피부를 벗겨 내고 표면 근막이 기본 panniculus carnosus 근육과 손상되지 않도록하십시오.적출된 조직을 50 내지 100 밀리리터의 차가운 DMEM F-12 배지로 세척하여 오염된 혈액을 제거한다. 그런 다음, 행크스 균형 소금 용액으로 조직을 세척하여 조직 및 세포 생존력을 유지한다. DMEM F-12 배지가 들어있는 10cm 페트리 접시에 표면 근막으로 피부를 거꾸로 놓습니다.그런 다음 일회용 두 밀리미터 생검 펀치를 사용하여 전체 두께의 둥근 피부 조각을 소비하여 딱지가있는 조직을 생성하여 표피까지 기본 panniculus carnosus 근육으로 표면 근막이 손상되지 않도록하십시오. 페놀 레드가 없는 신선한 DMEM F-12 완전 배지 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 멸균 포셉을 사용하여 딱지가 달린 개별 조직을 거꾸로 96웰 플레이트의 웰로 옮기고 완전히 잠급니다.플레이트를 표준 조건 하에 유지된 세포 배양 배양기로 옮긴다. 배양 이틀 및 네 번째 날에, 웰에 10 마이크로리터를 남기고 신선한 미리 가온된 DMEM F-12 완전 배지를 치료 화합물과 함께 첨가하여 지속적인 세포 및 조직 생존력 조건을 유지한다. SCAD의 라이브 이미징을 위해, 마이크로파에서 가열하여 유리 병에 PBS에 2 내지 3%의 저융점 아가로스 용액 30밀리리터를 준비한다.끓인 후, 즉시 병을 옮기고 액체 아가로스 용액을 섭씨 40도 수조에서 식히십시오. 다음으로, 근막 또는 흉터가 위쪽을 향하도록 SCAD 조직을 35mm 접시의 중앙으로 옮깁니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 섭씨 40도 액체 아가로스를 천천히 부어 실온에서 SCAD를 내장하였다.아가로스는 두 분 안에 중합된다. 중합 후, 미리 예열된 DMEM F-12 완전 배지 2밀리리터를 첨가한다. 그런 다음 원고에 설명 된 적절한 인큐베이션 시스템을 갖춘 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 제로 일에서 첫날까지의 시간 경과 이미지를 획득하십시오.조직 수확을 위해, 배지를 멸균 PBS로 교체함으로써 관련 시점에서 조직을 세척한다. 멸균 포셉을 사용하여 각 SCAD를 2% 파라포름알데히드 500마이크로리터가 들어있는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 조직을 고정시킵니다. 다음날, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 두 가지 또는 입체 면역형광 염색을 진행하기 전에 PBS로 조직을 세 번 세척한다.0일과 다섯 일째에 SCAD의 대표적인 전체 마운트 밝은 필드 이미지가 여기에 표시됩니다. 수직 조직 절편의 Masson의 삼색 염색은 조직 흉터, 조직 수축 및 흉터 코어에서 세포 외 매트릭스의 축적의 시그니처를 보여줍니다 0 및 다섯 일. SCADs의 면역형광 염색을 제로 및 오일째에 나타내었다.초기 및 후기 단계 흉터에서, 뿌리 내린 양성 섬유 아세포는 녹색으로, 뿌리 내린 부정적인 섬유 아세포는 빨간색으로 표시됩니다. 입체 영상화를 위해, 조직을 아가로스 용액에 포매하고 PBSGT로 얹었다. 대표적인 이미지는 하루 다섯 SCAD의 흉터 부위에서 N-cadherin 단백질의 배타적 국소화를 입증한다.인큐베이션 챔버가 장착 된 입체 시간 경과 이미징 설정은 처음 12 시간 또는 흉터 발달의 초기 단계에 걸쳐 섬유 아세포 떼의 진행의 초기 사건을 표시했습니다. 흉터 발달에 대한 개별 섬유아세포의 단일 세포 추적 세포 궤적의 그래픽 표현이 여기에 제시된다. SCAD 조직을 우물 플레이트 안쪽에 거꾸로 배치하여 근막이 위쪽을 향하도록 하는 것이 중요합니다.이렇게 하지 않으면 마이그레이션 패턴이 불가피하게 변경됩니다. 이 절차를 통해 화학적 조절제, 중화 항체 또는 바이러스 방법을 사용하여 치료 또는 배양을 위해 진피층을 검사 할 수 있습니다. 이것은 다양한 의료 환경에서 병리학 적 섬유성 반응을 평가하는 데 도움이됩니다.우리는 상처시 근막 동원에 관여하는 핵심 분자로서 connexin-43과 N-cadherin의 발현을 보여주었습니다. SCAD 방법론은 흉터와 섬유증을 줄이기위한 새로운 치료 전략의 식별을 가능하게합니다.

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G 단백질 선택적 G​​PCR의 입체는 라이브 셀 서스펜션 형광 분석에서 FRET 센서를 사용하여 측정

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...