Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Vi anerkjenner alle medforfatterne av Jiang et al. 2020 for å bidra til utviklingen av SCAD-metodikk13. Vi takker Dr. Steffen Dietzel og Bioimaging kjerneanlegg på Ludwig-Maximilans-Universität for tilgang til Multiphoton-systemet. Y.R. ble støttet av Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) og LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Modellen som presenteres nedenfor gir en detaljert trinnvis beskrivelse av generasjonen av SCAD-analyse som kort beskrevet i Jiang et al., 202013. SCAD prøveforberedelser ble utført etter å ha ofret dyrene i henhold til internasjonale og regjeringen i Øvre Bayern retningslinjer. Dyr ble plassert på dyreanlegget til Helmholtz Centre Munich. Rommene ble opprettholdt med optimal fuktighet og konstant temperatur med en 12 timers lyssyklus. Dyr ble forsynt med mat og vann ad libitum.
...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Flere modeller er allerede utviklet for å forstå arrdannelse etter skade. Mens mange fremskritt har blitt gjengitt i denne forbindelse, men, er faktiske mekanismer fortsatt ikke klare. I motsetning til den forrige teknikken inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag, og opprettholder dermed kompleksiteten i innfødt hud18,19. Denne metodikken er i stand til å generere grunnleggende datasett som er viktige for å forstå molekylære mekanismer som...

Sårheling er en prosess for restaurering av brutte sår. Vevsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fullstendig regenerering. I motsetning reagerer pattedyr på dyp skade ved arrdannelse, en prosess skreddersydd for raskt å forsegle sår med tette plugger av matrisefibre som minimerer det brutte området og samtidig permanent deformerer det skadede stedet 1,2,3. Store hudforbrenninger eller dype åpne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fenotyper som hypertrofiske eller keloid arr 4,5. Disse sprudlende arrene forårsaker en enorm byrde på kliniske og globale helsesystemer. Bare i USA koster arrhåndtering rundt 10 milliarder dollar årlig 6,7. Derfor er utviklingen av relevante metoder nødvendig for å bedre forstå de fundementale prosessene og mekanismene som er involvert i arrdannelse.
I de senere år har et bredt spekter av studier på mus avslørt heterogene fibroblastpopulasjoner med distinkte funksjonelle potenser basert på deres opprinnelse på visse hudsteder 8,9,10. I bakhuden identifiserte Rinkevich et al., 2015, at en bestemt fibroblastpopulasjon med et tidlig embryonalt uttrykk for Engrailed-1 (En1), kalt EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar til kutan arrdannelse ved såring. Motsatt bidrar en annen fibroblast avledning uten historie med innfelt uttrykk, Innfelt negativ fibroblast (ENF), ikke til arrdannelse8. Skjebnekartlegging av disse En1-linjene ved hjelp av Cre-drevne transgene muselinjer krysset til fluorescensreportermuselinjer som R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) tillater visualisering av EPF- og ENF-populasjoner.
Å studere fibroblast migrasjon in vivo over flere dager er begrenset av etiske og tekniske begrensninger. Videre er sammensatte, virale og nøytraliserende antistoffbibliotekskjermer for å modulere veier involvert i arrdannelse teknisk utfordrende. Tidligere brukte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler evnen til å visualisere fibroblastmigrasjon og arrdannelse i ekte hudmikromiljøer, ensartethet i arrutvikling, samt vevskompleksitet som emulerer in vivo hudmiljøer11,12. For å overvinne de ovennevnte begrensningene utviklet vi en ex vivo scarring analyse kalt SCAD (SCar-lignende vev i A Dish)13,14. Denne enkle analysen kan utføres ved å utskille 2 mm fulltykkelseshud som inneholder epidermis, dermis og de subkutane fasciaområdene og dyrke dem i serum-supplerte DMSO-medier i opptil 5 dager. Arr generert fra SCAD gjenskaper pålitelig transkripsjons- og proteomiske kjennetegn på in vivo arr. I tillegg kan SCADer generert fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krysset med fluorescerende reportermuslinjer tillate visualisering av fibroblast migrasjonsdynamikk og arrutvikling med en enestående oppløsning. Videre kan denne modellen enkelt tilpasses for alle bruksområder med høy gjennomstrømning (f.eks. sammensatt bibliotek, antistoffbibliotek eller viral screening)13,14. I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert protokoll for å generere SCADs og påfølgende nedstrøms prosesseringsprogrammer for å studere cellulær og matrisedynamikk i arrutvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

Pattedyrets globale respons på tetting av dype vevssår er gjennom arrdannelse og vevskontraksjon, mediert av spesialiserte fasciafibroblaster. Til tross for den kliniske betydningen av arrdannelse og nedsatt sårheling, er vår forståelse av fascia fibroblastdynamikk i sårheling kortfattet på grunn av mangel på relevante analyser som muliggjør direkte visualisering av fibroblastkoreografi og dynamikk i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papiret presenterer en protokoll for å generere ex-situ hud arr ved hjelp av SCAD eller "SCar-lignende vev i en tallerken" som etterligner det komplekse miljøet av hudsår. I denne analysen utskilles 2 mm hud med full tykkelse og dyrkes opp ned i media i 5 dager, hvor arr og hudkontrakturer utvikler seg jevnt. Denne metodikken, kombinert med fibroblast-avledningsspesifikke transgene musemodeller, muliggjør visualisering av individuelle fibroblastavledninger over hele sårreparasjonsprosessen. Samlet sett hjelper denne protokollen forskere med å forstå grunnleggende prosesser og mekanismer for sårreparasjon, og utforsker direkte effekten av modulatorer på sårhelingsresultater.

Generering av SCADs kan deles inn i tre viktige trinn: Høsting av tilbake hud fra P0-P1 mus, generering av biopsislag i full tykkelse og påfølgende kultur av individuelle scads opptil 5 dager i 96-brønnsplater. Som en avlesning kan denne analysen videre brukes til å analysere de romlige og tidsmessige aspektene ved arrdannelse. Den romlige analysen benytter 2D og 3D immunmerking av vev for å studere romlig lokalisering av cellulære og matrisekomponenter innen utvikling av arrvev. Romlige studier tillater visualise...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Denne protokollen beskriver genereringen av en hudfascia utviset kalt "SCar like tissue in A Dish" eller SCAD. Denne modellen tillater enestående visualisering av enkle fibroblaster under arrdannelse.

Visualisere arrutvikling ved hjelp av SCAD Assay - En Ex-situ skin scarring assay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Tidligere brukte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler dermale cellekomponenter og kompleksitet i hudvev. Denne ex situ SCAD-analysen overvinner en fast begrensning og gjør det mulig å studere utviklingen av arr utenfor såret dyr. SCAD-analysen tillater visualisering av fibroblastmigrasjon og arrdannelse i hudmikromiljøet.Det gjør det mulig å screening biblioteker av aktivatorer eller inhibitorer å forstå det mekanistiske grunnlaget for arrdannelse. Screeninganalyser av flate biblioteker med høy gjennomstrømning ved hjelp av SCAD-modellen for å forstå grunnleggende prosess og molekylkurset involvert i sårreparasjon. SCAD-analysen er enkel å utføre ved hjelp av hudutløpene.For konsekvent arr anbefales det å velge postnatal dag null eller dag en hud. Etter å ha ofret postnatal dag null eller dag én nyfødt valp, bruk en steril kirurgisk skalpell for å forsiktig utskille 1,5 x 1,5 centimeter full tykkelse dorsal rygghud til skjelettmuskulaturlaget. Skrell huden ved hjelp av sterile buede tang, og sørg for at den overfladiske fascia er intakt med den underliggende panniculus carnosus muskelen.Vask det utskilte vevet med 50 til 100 milliliter kaldt DMEM F-12 medium for å fjerne forurensende blod. Vask deretter vevet med Hanks balansert saltoppløsning for å opprettholde vev og celle levedyktighet. Legg huden opp ned med overfladisk fascia på toppen i en 10-centimeter Petri-tallerken som inneholder DMEM F-12 medium.Deretter, ved hjelp av en engangs to millimeter biopsi punch, excise full tykkelse runde hudstykker for å generere scabbed vev, sikre at overfladisk fascia er intakt med underliggende panniculus carnosus muskel til epidermis. Tilsett 200 mikroliter fersk DMEM F-12 komplett medium uten fenolrød i hver brønn på en 96-brønnsplate. Bruk sterile tang, overfør og senk det individuelle scabbed vevet helt opp ned til brønnene på en 96-brønnsplate.Overfør platen til en cellekulturinkubator som vedlikeholdes under standardforhold. På dag to og fire av kulturen, fjern mediet som forlater 10 mikroliter i brønnen og tilsett ferske forvarmede DMEM F-12 komplette medium sammen med behandlingsforbindelsene for å opprettholde fortsatte celle- og vevs levedyktighetsforhold. For levende avbildning av SCADs, lag 30 milliliter 2 til 3% lavsmelting agarose løsning i PBS i en glassflaske ved oppvarming i en mikrobølgeovn.Etter koking, overfør straks flasken og avkjøl væsken agarose løsning i et 40 grader Celsius vannbad. Deretter overfører du SCAD-vevet med fascia eller arr vendt oppover til midten av en 35 millimeter tallerken. Deretter legger du inn SCAD ved romtemperatur ved å sakte helle 40 grader Celsius væske agarose på vevet ved hjelp av en 1000-mikroliter pipettespiss.Agarose polymeriserer innen to minutter. Etter polymerisering, tilsett to milliliter forvarmet DMEM F-12 komplett medium. Deretter bruker du et konfokalt eller et multifotonmikroskop utstyrt med egnede inkubasjonssystemer forklart i manuskriptet, og skaffer seg tidsforløpbilder av dag null til dag én.For vevshøsting, vask vevet på relevante tidspunkter ved å erstatte mediet med steril PBS. Bruk sterile tang, overfør hver SCAD til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør som inneholder 500 mikroliter av 2% paraformaldehyd for å fikse vevet over natten ved fire grader Celsius. Neste dag vasker du vevet tre ganger med PBS før du går videre til to- eller tredimensjonal immunfluorescensfarging som beskrevet i tekstmanuskriptet.De representative helmonterte lysfeltbildene av SCADer på dag null og fem vises her. Massons trichrome farging av vertikale vev seksjoner avslører signaturer av vev arrdannelse, vev sammentrekning, og akkumulering av ekstracellulær matrise på arrkjernen på dager null og fem. Immunfluorescensfarging av SCADs på dag null og fem er vist.Fra tidlig og sen stadium arr, inngrodd positiv fibroblast er vist i grønt og inngrodd negativ fibroblast i rødt. For tredimensjonal avbildning ble vev innebygd i agaroseoppløsning og toppet med PBSGT. De representative bildene viser eksklusiv lokalisering av N-kadherinprotein på arrstedet til en dag-fem SCAD.Det tredimensjonale tidsforløpavbildningsoppsettet utstyrt med et inkubasjonskammer viste tidlige hendelser av progresjon av fibroblastsvermene i løpet av de første 12 timene eller tidlige stadier av arrutvikling. Den grafiske representasjonen av encellede sporede cellulære baner av individuelle fibroblaster over arrutvikling presenteres her. Det er avgjørende å plassere SCAD-vevet opp ned inne i brønnplaten slik at fasciaen vender oppover.Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i uunngåelige variasjoner i migrasjonsmønstre. Denne prosedyren gjør det mulig å undersøke dermale lag for behandlinger eller kultur ved hjelp av kjemiske modulatorer, nøytraliserende antistoffer eller virale metoder. Dette hjelper i vurderingen av patologiske fibrotiske responser på tvers av ulike medisinske innstillinger.Vi viste uttrykk for connexin-43 og N-kadherin som viktige molekyler involvert i fasciamobilisering ved såring. SCAD-metodikken gjør det mulig å identifisere nye terapeutiske strategier for å begrense arrdannelse og fibrose.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en Capture ELISA til en Luminex xMAP Assay bruker en Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Måle effekten av bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Behavior Ved hjelp av en Egg Retention analysen

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Utvikling av en kvantitativ rekombinase Polymerase Amplification analysen med en intern positiv kontroll

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selektive GPCR conformations måles ved hjelp av FRET sensorer i en levende celle Suspension fluorometer analysen

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Evaluere vaskulær Hyperpermeability-inducing agenter i huden med Miles analysen

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...