Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
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Reconocemos a todos los coautores de Jiang et al. 2020 por contribuir al desarrollo de la metodología SCAD13. Agradecemos al Dr. Steffen Dietzel y a las instalaciones centrales de Bioimagen en la Ludwig-Maximilans-Universität por el acceso al sistema Multiphoton. Y.R. contó con el apoyo de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), la European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) y la Fundación LEO (LF-OC-21-000835).

El modelo que se presenta a continuación proporciona una descripción detallada paso a paso de la generación del ensayo SCAD como se describe brevemente en Jiang et al., 202013. Las preparaciones de muestras de SCAD se realizaron después de sacrificar a los animales según las directrices internacionales y del Gobierno de Alta Baviera. Los animales fueron alojados en las instalaciones para animales del Centro Helmholtz de Múnich. Las habitaciones se mantuvieron con una humedad óptima y una te...

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	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. 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Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Ya se han desarrollado varios modelos para comprender la formación de cicatrices después de una lesión. Si bien se han logrado muchos avances en este sentido, los mecanismos reales aún no están claros. A diferencia de la técnica anterior, el modelo SCAD incorpora todos los tipos celulares y capas cutáneas, manteniendo así la complejidad de la piel nativa18,19. Esta metodología es capaz de generar conjuntos de datos fundamentales que son importantes para ...

La cicatrización de heridas es un proceso de restauración de heridas rotas. Las lesiones tisulares en invertebrados resultan en una regeneración parcial o completa. Por el contrario, los mamíferos responden a las lesiones profundas mediante cicatrices, un proceso diseñado para sellar rápidamente las heridas con densos tapones de fibras de matriz que minimizan el área quebrantada y al mismo tiempo deforman permanentemente el sitio lesionado 1,2,3. Las grandes quemaduras en la piel o las heridas abiertas profundas en los mamíferos dan lugar a fenotipos patológicos como cicatrices hipertróficas o queloides 4,5. Estas cicatrices exuberantes causan una tremenda carga en los sistemas de salud clínicos y globales. Solo en los Estados Unidos, el manejo de cicatrices cuesta alrededor de $ 10 mil millones anuales 6,7. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de metodologías relevantes para comprender mejor los procesos y mecanismos fundementales involucrados en la formación de cicatrices.
En los últimos años, una amplia gama de estudios en ratones ha revelado poblaciones heterogéneas de fibroblastos con distintas potencias funcionales basadas en sus orígenes en ciertas ubicaciones de la piel 8,9,10. En la piel posterior, Rinkevich et al., 2015, identificaron que una población específica de fibroblastos con una expresión embrionaria temprana de Engrailed-1 (En1), denominada EPF (Fibroblasto Positivo Engrailed) contribuye a la cicatrización cutánea al enrollarse. Por el contrario, otro linaje de fibroblastos sin antecedentes de expresión engrailed, el fibroblasto negativo engrailed (ENF), no contribuye a la formación de cicatrices8. El mapeo del destino de estos linajes En1 utilizando líneas de ratones transgénicos impulsadas por Cre cruzadas a líneas de ratón reporteros de fluorescencia como R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) permite la visualización de poblaciones de EPF y ENF.
El estudio de la migración de fibroblastos in vivo durante varios días está limitado por restricciones éticas y técnicas. Además, las pantallas de biblioteca de anticuerpos compuestos, virales y neutralizantes para modular las vías involucradas en la cicatrización son técnicamente desafiantes. Los modelos in vitro o ex vivo utilizados anteriormente carecen de la capacidad de visualizar la migración de fibroblastos y la formación de cicatrices en microambientes cutáneos genuinos, uniformidad en el desarrollo de cicatrices, así como complejidad tisular que emula entornos cutáneos in vivo 11,12. Para superar las limitaciones anteriores, desarrollamos un ensayo de cicatrización ex vivo denominado SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Este ensayo simple se puede realizar extirpando la piel de 2 mm de espesor completo que contiene la epidermis, la dermis y las regiones de la fascia subcutánea y cultivándolas en medios DMSO suplementados con suero durante un máximo de 5 días. Las cicatrices generadas a partir de SCAD replican de manera confiable las características transcriptómicas y proteómicas de las cicatrices in vivo. Además, los SCAM generados a partir de líneas de ratones transgénicos relevantes (por ejemplo, ratones En1) cruzados con líneas de ratones reporteros fluorescentes permiten la visualización de la dinámica de migración de fibroblastos y el desarrollo de cicatrices a una resolución sin precedentes. Además, este modelo se puede adaptar fácilmente para cualquier aplicación de alto rendimiento (por ejemplo, biblioteca de compuestos, biblioteca de anticuerpos o cribado viral)13,14. En este artículo, describimos un protocolo optimizado para generar SCADs y posteriores aplicaciones de procesamiento aguas abajo para estudiar la dinámica celular y matricial en el desarrollo de cicatrices.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

La respuesta global de los mamíferos al sellado de heridas de tejido profundo es a través de la formación de cicatrices y la contracción del tejido, mediada por fibroblastos especializados en la fascia. A pesar de la importancia clínica de la formación de cicatrices y la cicatrización deficiente de heridas, nuestra comprensión de la dinámica de los fibroblastos de la fascia en la cicatrización de heridas es superficial debido a la falta de ensayos relevantes que permitan la visualización directa de la coreografía y la dinámica de los fibroblastos en entornos complejos, como en heridas cutáneas. Este artículo presenta un protocolo para generar cicatrices cutáneas ex situ utilizando SCAD o "tejido similar a SCar en un plato" que emulan el complejo entorno de las heridas cutáneas. En este ensayo, la piel de 2 mm de espesor completo se extirpa y se cultiva boca abajo en medios durante 5 días, durante los cuales las cicatrices y las contracturas de la piel se desarrollan de manera uniforme. Esta metodología, junto con modelos de ratón transgénico específicos del linaje de fibroblastos, permite la visualización de linajes de fibroblastos individuales en todo el proceso de reparación de heridas. En general, este protocolo ayuda a los investigadores a comprender los procesos y mecanismos fundamentales de reparación de heridas, explorando directamente los efectos de los moduladores en los resultados de curación de heridas.

La generación de SCADs se puede separar en tres pasos esenciales: Recolección de piel de ratones P0-P1, generación de punzones de biopsia de espesor completo y posterior cultivo de scads individuales hasta 5 días en placas de 96 pocillos. Como lectura, este ensayo se puede aplicar para analizar los aspectos espaciales y temporales de la cicatrización. El análisis espacial utiliza el marcado inmune 2D y 3D de los tejidos para estudiar la localización espacial de los componentes celulares y matriciales dentro del te...

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Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Este protocolo describe la generación de un explante de piel-fascia denominado "tejido similar a SCar en un plato" o SCAD. Este modelo permite una visualización sin precedentes de fibroblastos individuales durante la formación de cicatrices.

Visualización del desarrollo de cicatrices mediante el ensayo SCAD: un ensayo de cicatrización cutánea ex situ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Los modelos utilizados anteriormente in vitro o ex vivo carecen de componentes de células dérmicas y complejidad del tejido de la piel. Este ensayo SCAD ex situ supera una limitación establecida y permite estudiar el desarrollo de cicatrices fuera del animal herido. El ensayo SCAD permite la visualización de la migración de fibroblastos y la formación de cicatrices en microambientes de la piel.Permite a las bibliotecas de detección de activadores o inhibidores comprender la base mecanicista de la formación de cicatrices. Ensayos de detección de alto rendimiento de bibliotecas planas utilizando el modelo SCAD para comprender el proceso fundamental y el curso de la molécula involucrado en la reparación de heridas. El ensayo SCAD es fácil de realizar utilizando los explantes de piel.Para una cicatriz consistente, se recomienda seleccionar la piel postnatal del día cero o del primer día. Después de sacrificar el día cero postnatal o el cachorro recién nacido del primer día, use un bisturí quirúrgico estéril para extirpar cuidadosamente la piel dorsal dorsal de 1.5 por 1.5 centímetros de espesor completo hasta la capa muscular esquelética. Pelar la piel con pinzas curvas estériles, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente.Lave el tejido extirpado con 50 a 100 mililitros de medio frío DMEM F-12 para eliminar la sangre contaminante. Luego, lave el tejido con la solución de sal equilibrada de Hanks para mantener la viabilidad del tejido y las células. Coloque la piel boca abajo con la fascia superficial en la parte superior en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga DMEM F-12 medio.Luego, usando un punzón desechable de biopsia de dos milímetros, extirpe piezas de piel redondas de espesor completo para generar tejidos con costras, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente hasta la epidermis. Agregue 200 microlitros de medio completo DMEM F-12 fresco sin rojo fenol en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Usando fórceps estériles, transfiera y sumerja completamente el tejido de costras individual boca abajo a los pocillos de una placa de 96 pocillos.Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular mantenida en condiciones estándar. En los días dos y cuatro de cultivo, retire el medio dejando 10 microlitros en el pozo y agregue un medio completo DMEM F-12 fresco precalentado junto con los compuestos de tratamiento para mantener las condiciones de viabilidad celular y tisular continuas. Para obtener imágenes en vivo de SCADs, prepare 30 mililitros de solución de agarosa de baja fusión al 2 a 3% en PBS en una botella de vidrio calentando en un microondas.Después de hervir, transfiera inmediatamente la botella y enfríe la solución líquida de agarosa en un baño de agua de 40 grados centígrados. A continuación, transfiera el tejido SCAD con fascia o cicatriz hacia arriba en el centro de un plato de 35 milímetros. Luego incruste el SCAD a temperatura ambiente vertiendo lentamente agarosa líquida de 40 grados Celsius sobre el tejido usando una punta de pipeta de 1000 microlitros.La agarosa polimeriza en dos minutos. Después de la polimerización, agregue dos mililitros de medio completo DMEM F-12 precalentado. Luego, utilizando un microscopio confocal o multifotónico equipado con sistemas de incubación adecuados explicados en el manuscrito, adquiera imágenes de lapso de tiempo del día cero al día uno.Para la recolección de tejidos, lave los tejidos en los puntos de tiempo relevantes reemplazando el medio con PBS estéril. Usando pinzas estériles, transfiera cada SCAD a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de paraformaldehído al 2% para fijar los tejidos durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave los tejidos tres veces con PBS antes de proceder a la tinción de inmunofluorescencia bidimensional o tridimensional como se describe en el manuscrito de texto.Las imágenes representativas de campo brillante de montaje completo de SCAD en los días cero y cinco se muestran aquí. La tinción tricrómica de Masson de secciones verticales de tejido revela firmas de cicatrización tisular, contracción tisular y acumulación de matriz extracelular en el núcleo de la cicatriz en los días cero y cinco. Se muestra la tinción de inmunofluorescencia de los SCADs en los días cero y cinco.Desde la cicatriz temprana y tardía, el fibroblasto positivo arraigado se muestra en verde y el fibroblasto negativo arraigado en rojo. Para las imágenes tridimensionales, los tejidos se incrustaron en una solución de agarosa y se cubrieron con PBSGT. Las imágenes representativas demuestran la localización exclusiva de la proteína N-cadherina en el sitio de la cicatriz de un SCAD del día cinco.La configuración de imágenes de lapso de tiempo tridimensional equipada con una cámara de incubación mostró eventos tempranos de progresión de los enjambres de fibroblastos durante las primeras 12 horas o las primeras etapas del desarrollo de la cicatriz. Aquí se presenta la representación gráfica de las trayectorias celulares rastreadas por una sola célula de fibroblastos individuales durante el desarrollo de cicatrices. Es crucial colocar el tejido SCAD boca abajo dentro de la placa del pozo para que la fascia mire hacia arriba.De lo contrario, se producirían variaciones inevitables en los patrones de migración. Este procedimiento permite examinar las capas dérmicas para tratamientos o cultivos utilizando moduladores químicos, anticuerpos neutralizantes o métodos virales. Esto ayuda en la evaluación de las respuestas fibróticas patológicas en diversos entornos médicos.Mostramos la expresión de conexina-43 y N-cadherina como moléculas clave involucradas en la movilización de la fascia al enrollarse. La metodología SCAD permite la identificación de nuevas estrategias terapéuticas para reducir la cicatrización y la fibrosis.

Research

JoVE Journal

Biology

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