Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Vi erkänner alla medförfattare till Jiang et al.2020 för att ha bidragit till utvecklingen av SCAD-metodik13. Vi tackar Dr. Steffen Dietzel och Bioimaging-kärnanläggningen vid Ludwig-Maximilans-Universität för tillgång till Multiphoton-systemet. Y.R. stöddes av Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) och LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Modellen som presenteras nedan ger en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av genereringen av SCAD-analys som kortfattat beskrivs i Jiang et al., 202013. SCAD-provberedningar utfördes efter att djuren offrats enligt de internationella och överbayerska regeringens riktlinjer. Djur inhystes på djuranläggningen i Helmholtzcentret i München. Rummen upprätthölls med optimal luftfuktighet och konstant temperatur med en 12 h ljuscykel. Djur försågs med mat och vatten ad libitum.
<p...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Flera modeller har redan utvecklats för att förstå ärrbildning efter skada. Även om många framsteg har gjorts i detta avseende, men de faktiska mekanismerna är fortfarande inte tydliga. Till skillnad från den tidigare tekniken innehåller SCAD-modellen alla celltyper och kutana lager, vilket bibehåller komplexiteten hos den ursprungliga huden18,19. Denna metod kan generera grundläggande datamängder som är viktiga för att förstå molekylära mekanism...

Sårläkning är en process för restaurering av brutna sår. Vävnadsskador hos ryggradslösa djur resulterar i partiell eller fullständig regenerering. Däremot svarar däggdjur på djup skada genom ärrbildning, en process skräddarsydd för att snabbt täta sår med täta pluggar av matrisfibrer som minimerar det brutna området och samtidigt permanent deformerar det skadade stället 1,2,3. Stora hudbrännskador eller djupa öppna sår hos däggdjur resulterar i patologiska fenotyper som hypertrofiska eller keloidärr 4,5. Dessa sprudlande ärr orsakar en enorm börda för kliniska och globala sjukvårdssystem. Bara i USA kostar ärrhantering cirka 10 miljarder dollar årligen 6,7. Därför krävs utveckling av relevanta metoder för att bättre förstå de fundementala processer och mekanismer som är involverade i ärrbildning.
Under de senaste åren har ett brett spektrum av studier på möss avslöjat heterogena fibroblastpopulationer med distinkta funktionella potenser baserat på deras ursprung på vissa hudplatser 8,9,10. I bakhuden identifierade Rinkevich et al., 2015, att en specifik fibroblastpopulation med ett tidigt embryonalt uttryck av Engrailed-1 (En1), kallad EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar till kutan ärrbildning vid sårbildning. Omvänt bidrar en annan fibroblastlinje utan historia av insnärjt uttryck, Engrailed negative fibroblast (ENF), inte till ärrbildning8. Ödeskartläggning av dessa En1-linjer med hjälp av Cre-drivna transgena muslinjer korsade till fluorescensreportermuslinjer som R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) möjliggör visualisering av EPF- och ENF-populationer.
Att studera fibroblastmigration in vivo under flera dagar begränsas av etiska och tekniska begränsningar. Dessutom är sammansatta, virala och neutraliserande antikroppsbiblioteksskärmar för att modulera vägar som är involverade i ärrbildning tekniskt utmanande. Tidigare använda in vitro- eller ex vivo-modeller saknar förmågan att visualisera fibroblastmigration och ärrbildning i äkta hudmikromiljöer, enhetlighet i ärrutveckling samt vävnadskomplexitet som emulerar in vivo hudmiljöer11,12. För att övervinna ovanstående begränsningar utvecklade vi en ex vivo ärrbildningsanalys som kallas SCAD (SCar-liknande vävnad i en maträtt)13,14. Denna enkla analys kan utföras genom att excitera 2 mm fullhudshud som innehåller epidermis, dermis och subkutan fascia och odla dem i serumkompletterade DMSO-medier i upp till 5 dagar. Ärr som genereras från SCAD replikerar på ett tillförlitligt sätt transkriptomiska och proteomiska kännetecken för in vivo-ärr. Dessutom möjliggör SCAD: er genererade från relevanta transgena muslinjer (t.ex. En1-möss) korsade med fluorescerande reportermuslinjer visualisering av fibroblastmigrationsdynamik och ärrutveckling med en aldrig tidigare skådad upplösning. Dessutom kan denna modell enkelt anpassas för alla applikationer med hög genomströmning (t.ex. sammansatt bibliotek, antikroppsbibliotek eller viral screening)13,14. I den här artikeln beskriver vi ett optimerat protokoll för att generera SCADs och efterföljande nedströms bearbetningsapplikationer för att studera cell- och matrisdynamik i ärrutveckling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

Däggdjurets globala svar på tätning av djupa vävnadssår är genom ärrbildning och vävnadskontraktion, medierad av specialiserade fasciafibroblaster. Trots den kliniska betydelsen av ärrbildning och nedsatt sårläkning är vår förståelse av fasciafibroblastdynamik vid sårläkning kortfattad på grund av bristen på relevanta analyser som möjliggör direkt visualisering av fibroblastkoreografi och dynamik i komplexa miljöer som i hudsår. Detta dokument presenterar ett protokoll för att generera ex- situ hudärr med SCAD eller "SCar-liknande vävnad i en maträtt" som efterliknar den komplexa miljön av hudsår. I denna analys skärs 2 mm hud i full tjocklek ut och odlas upp och ner i media i 5 dagar, under vilka ärr och hudkontrakturer utvecklas enhetligt. Denna metodik, i kombination med fibroblast-härstamningsspecifika transgena musmodeller, möjliggör visualisering av enskilda fibroblastlinjer över hela sårreparationsprocessen. Sammantaget hjälper detta protokoll forskare att förstå grundläggande processer och mekanismer för sårreparation, direkt utforska effekterna av modulatorer på sårläkningsresultat.

Generering av SCADs kan delas in i tre viktiga steg: Skörda tillbaka huden från P0-P1-möss, generera biopsistansar i full tjocklek och efterföljande odling av enskilda scads upp till 5 dagar i 96-brunnsplattor. Som en avläsning kan denna analys vidare tillämpas för att analysera de rumsliga och tidsmässiga aspekterna av ärrbildning. Den rumsliga analysen använder 2D- och 3D-immunmärkning av vävnader för att studera rumslig lokalisering av cellulära och matriskomponenter inom utvecklande ärrvävnad. Spatiot...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Detta protokoll beskriver genereringen av en hudfascia explantad som kallas "SCar som vävnad i en maträtt" eller SCAD. Denna modell möjliggör oöverträffad visualisering av enstaka fibroblaster under ärrbildning.

Visualisera ärrutveckling med SCAD-analys - En ex-situ hudärrbildningsanalys

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Tidigare använda in vitro- eller ex vivo-modeller saknar dermala cellkomponenter och komplexitet i hudvävnad. Denna ex situ SCAD-analys övervinner en viss begränsning och gör det möjligt att studera utvecklingen av ärr utanför sårat djur. SCAD-analysen möjliggör visualisering av fibroblastmigration och ärrbildning i hudmikromiljöer.Det gör det möjligt att screena bibliotek av aktivatorer eller hämmare för att förstå den mekanistiska grunden för ärrbildning. Screeninganalyser med hög genomströmning av platta bibliotek med hjälp av SCAD-modellen för att förstå grundläggande process och molekylförloppet som är involverat i sårreparation. SCAD-analysen är lätt att utföra med hjälp av hudens utplanteringar.För konsekvent ärr rekommenderas att du väljer noll efter födseln eller dag ett hud. Efter att ha offrat efter födseln dag noll eller dag ett nyfödd valp, använd en steril kirurgisk skalpell för att försiktigt skära ut 1,5 x 1,5 centimeter rygghud i full tjocklek till skelettmuskelskiktet. Skala huden med sterila böjda pincett, se till att den ytliga fascian är intakt med den underliggande panniculus carnosus muskeln.Tvätta den utskurna vävnaden med 50 till 100 ml kallt DMEM F-12-medium för att avlägsna förorenande blod. Tvätta sedan vävnaden med Hanks balanserad saltlösning för att bibehålla vävnads- och cellviabiliteten. Placera huden upp och ner med ytlig fascia ovanpå i en 10 centimeter petriskål som innehåller DMEM F-12 medium.Sedan, med hjälp av en engångs två millimeter biopsistans, skära ut runda hudbitar i full tjocklek för att generera skabbvävnader, vilket säkerställer att ytlig fascia är intakt med underliggande panniculus carnosus-muskel fram till epidermis. Tillsätt 200 mikroliter färsk DMEM F-12 komplett medium utan fenolrött i varje brunn på en 96-brunnsplatta. Använd sterila pincett, överför och helt nedsänka individuell skabbvävnad upp och ner till brunnarna på en 96-brunnsplatta.Överför plattan till en cellodlingsinkubator som upprätthålls under standardförhållanden. På dag två och fyra av kulturen, ta bort mediet som lämnar 10 mikroliter i brunnen och tillsätt färskt förvärmt DMEM F-12 komplett medium tillsammans med behandlingsföreningarna för att upprätthålla fortsatta cell- och vävnadsviabilitetsförhållanden. För levande avbildning av SCADs, förbered 30 ml 2 till 3% lågsmältande agaroslösning i PBS i en glasflaska genom uppvärmning i en mikrovågsugn.Efter kokning, överför omedelbart flaskan och kyla den flytande agaroslösningen i ett 40 grader Celsius vattenbad. Överför sedan SCAD-vävnaden med fascia eller ärr vänd uppåt på mitten av en 35-millimeters skål. Bädda sedan in SCAD vid rumstemperatur genom att långsamt hälla 40 grader Celsius flytande agaros på vävnaden med en 1000 mikroliterpipettspets.Agaros polymeriseras inom två minuter. Efter polymerisation tillsätt två milliliter förvärmt DMEM F-12 komplett medium. Använd sedan ett konfokalt eller ett multifotonmikroskop utrustat med lämpliga inkubationssystem som förklaras i manuskriptet, skaffa tidsfördröjningsbilder av dag noll till dag ett.För vävnadsskörd, tvätta vävnaderna vid relevanta tidpunkter genom att ersätta mediet med steril PBS. Använd sterila pincett, överför varje SCAD till ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör innehållande 500 mikroliter 2% paraformaldehyd för att fixera vävnaderna över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, tvätta vävnaderna tre gånger med PBS innan du fortsätter till två- eller tredimensionell immunofluorescensfärgning enligt beskrivningen i textmanuskriptet.De representativa helmonterade ljusfältsbilderna av SCAD: er på dag noll och fem visas här. Massons trikromfärgning av vertikala vävnadssektioner avslöjar signaturer av vävnadsärrbildning, vävnadskontraktion och ackumulering av extracellulär matris vid ärrkärnan vid dag noll och fem. Immunofluorescensfärgningen av SCADs vid dag noll och fem visas.Från tidigt och sent stadium ärr visas den invanda positiva fibroblasten i grönt och den invanda negativa fibroblasten i rött. För tredimensionell avbildning inbäddades vävnader i agaroslösning och toppades med PBSGT. De representativa bilderna visar exklusiv lokalisering av N-kadherinprotein på ärrplatsen för en dag-fem SCAD.Den tredimensionella tidsfördröjningsavbildningsinställningen utrustad med en inkubationskammare visade tidiga händelser av progression av fibroblastsvärmarna under de första 12 timmarna eller tidiga stadier av ärrutveckling. Den grafiska representationen av encellsspårade cellulära banor för enskilda fibroblaster över ärrutveckling presenteras här. Det är viktigt att placera SCAD-vävnaden upp och ner inuti brunnsplattan så att fascian vetter uppåt.Om detta inte görs skulle det leda till oundvikliga variationer i migrationsmönstren. Denna procedur gör det möjligt att undersöka dermala lager för behandlingar eller odling med hjälp av kemiska modulatorer, neutraliserande antikroppar eller virala metoder. Detta hjälper till vid bedömningen av patologiska fibrotiska svar i olika medicinska miljöer.Vi visade uttrycket av connexin-43 och N-cadherin som nyckelmolekyler involverade i fasciamobilisering vid sårning. SCAD-metoden gör det möjligt att identifiera nya terapeutiska strategier för att begränsa ärrbildning och fibros.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Titrering av mänskliga coronavirus Använda en immunofluorescensteknik analys

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualisera bultande hjärta i Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

En In vitro FluoroBlok tumör Invasion analys

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en ELISA för att en Luminex xMAP analys med hjälp av en Multiplex metod Antibody Screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Mätning av effekterna av bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Beteende användning av en analys Egg Retention

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Utveckling av en kvantitativ Recombinase polymeras amplifieringsanalysen med en intern positiv kontroll

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G-protein-selektiva GPCR konforma mäts med hjälp av FRET sensorer i en levande cell Suspension Fluorometer analys

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Utvärderande vaskulär Hyperpermeability-inducerande medel i huden med Miles-analys

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...