Name: visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

SCAD metodolojisinin geliştirilmesine katkıda bulundukları için Jiang et al. 2020'nin tüm ortak yazarlarına teşekkür ederiz13. Dr. Steffen Dietzel'e ve Ludwig-Maximilans-Universität'teki Biyogörüntüleme çekirdek tesisine Multiphoton sistemine erişim için teşekkür ederiz. Y.R., Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Bursu (ERC-CoG 819933) ve LEO Vakfı (LF-OC-21-000835) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda sunulan model, Jiang ve ark., 202013'te kısaca açıklandığı gibi SCAD testinin oluşturulmasının ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sunmaktadır. SCAD numune hazırlıkları, uluslararası ve Yukarı Bavyera Hükümeti yönergelerine uygun olarak hayvanlar kurban edildikten sonra gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Münih Helmholtz Merkezi'nin hayvan tesisinde barındırıldı. Odalar, 12 saatlik bir ışık döngüsü ile optimum nem ve sabit sıcaklık ile korunmuşt...

<ol>
	<li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation.">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li><li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+wound+healing:+an+update.">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li><li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+scars+and+keloids:+a+review+and+current+treatment+modalities.">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li><li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia.">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li><li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wounds+and+its+burden:+An+updated+compendium+of+estimates.">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151 (2015).</li><li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis.">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparisons+of+the+morphology,+migration,+cell+adhesions,+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices.">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li><li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin.">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds.">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ert&#252;rk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studies.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Animal+models+of+wound+healing).">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li></ol>

Yaralanma sonrası skar oluşumunu anlamak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bu konuda birçok ilerleme kaydedilmesine rağmen, gerçek mekanizmalar hala net değildir. Önceki tekniğin aksine, SCAD modeli tüm hücre tiplerini ve kutanöz tabakaları içerir, böylece doğal cildin karmaşıklığını korur18,19. Bu metodoloji, skar oluşumunu yönlendiren moleküler mekanizmaları anlamada önemli olan temel veri kümeleri üretebilir. Tahlil, basi...

Yara iyileşmesi, ihlal edilen yaraların restorasyonu sürecidir. Omurgasızlarda doku yaralanmaları kısmi veya tam rejenerasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, memeliler derin yaralanmalara yara izi bırakarak yanıt verirler; bu, ihlal edilen alanı en aza indiren ve aynı zamanda yaralı bölgeyi kalıcı olarak deforme eden yoğun matris lifleri tıkaçları ile yaraları hızlı bir şekilde kapatmak için uyarlanmış bir süreç 1,2,3. Memelilerde büyük deri yanıkları veya derin açık yaralar, hipertrofik veya keloid skarlar gibi patolojik fenotiplere neden olur 4,5. Bu coşkulu yara izleri, klinik ve küresel sağlık sistemleri üzerinde muazzam bir yüke neden olmaktadır. Sadece ABD'de, yara izi yönetimi yıllık yaklaşık 10 milyar dolara mal oluyor 6,7. Bu nedenle, skar oluşumunda rol oynayan temel süreçleri ve mekanizmaları daha iyi anlamak için ilgili metodolojilerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Son yıllarda, farelerde yapılan çok çeşitli çalışmalar, belirli cilt bölgelerindeki kökenlerine bağlı olarak farklı fonksiyonel potansiyellere sahip heterojen fibroblast popülasyonlarını ortaya koymuştur 8,9,10. Arka deride, Rinkevich ve ark., 2015, EPF (Engrailed pozitif fibroblast) olarak adlandırılan Engrailed-1'in (En1) erken embriyonik ekspresyonuna sahip spesifik bir fibroblast popülasyonunun, yaralanma üzerine kutanöz skarlaşmaya katkıda bulunduğunu tanımlamıştır. Tersine, engrailed ekspresyon öyküsü olmayan başka bir fibroblast soyu olan Engrailed negatif fibroblast (ENF), skar oluşumuna katkıda bulunmaz8. R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gibi floresan muhabir fare çizgilerine çapraz Cre-driven transgenik fare çizgileri kullanılarak bu En1 soylarının kader haritalanması, EPF ve ENF popülasyonlarının görselleştirilmesine olanak tanır.
Fibroblast göçünü birkaç gün boyunca in vivo olarak incelemek, etik ve teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Ayrıca, skarlaşmada rol oynayan yolları modüle etmek için bileşik, viral ve nötralize edici antikor kütüphanesi ekranları teknik olarak zordur. Daha önce kullanılan in vitro veya ex vivo modeller, gerçek cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünü ve skar oluşumunu, skar gelişiminde homojenliği ve in vivo cilt ortamlarını taklit eden doku karmaşıklığını görselleştirme yeteneğinden yoksundur 11,12. Yukarıdaki sınırlamaların üstesinden gelmek için, SCAD (Bir Çanakta SCar benzeri doku) 13,14 olarak adlandırılan bir ex vivo skar testi geliştirdik. Bu basit tahlil, epidermis, dermis ve deri altı fasya bölgelerini içeren 2 mm tam kalınlıkta cildin eksize edilmesi ve serum takviyeli DMSO ortamında 5 güne kadar kültürlenmesiyle gerçekleştirilebilir. SCAD'den üretilen skarlar, in vivo skarların transkriptomik ve proteomik özelliklerini güvenilir bir şekilde çoğaltır. Ek olarak, floresan muhabir fare çizgileriyle kesişen ilgili transgenik fare çizgilerinden (örneğin, En1 fareler) üretilen SCAD'ler, fibroblast göç dinamiklerinin ve yara izi gelişiminin benzeri görülmemiş bir çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu model herhangi bir yüksek verimli uygulama için kolayca uyarlanabilir (örneğin, bileşik kütüphanesi, antikor kütüphanesi veya viral tarama)13,14. Bu makalede, skar gelişiminde hücresel ve matris dinamiklerini incelemek için SCAD'ler ve ardından aşağı akış işleme uygulamaları oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td>
			<td>Biorad Laboratories</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>Adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>&#160;10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00 4959 52</td>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12381369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Heating system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680&#8211;1300 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00&#8201;W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS&#8201;+&#8201;Single)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>LIFE Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose ,25 g</td>
			<td>Biozym /Lonza</td>
			<td>859081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Matrix</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>6478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td>
			<td>Stiefel</td>
			<td>270130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15654444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal Bioxtra, 97%&#8211;101%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioimager M2 upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing scar development using scad assay - an ex-situ skin scarring assay

Memelilerin derin doku yaralarının kapatılmasına verdiği küresel yanıt, özel fasya fibroblastlarının aracılık ettiği skar oluşumu ve doku kasılması yoluyladır. Yara izi oluşumunun ve bozulmuş yara iyileşmesinin klinik önemine rağmen, yara iyileşmesinde fasya fibroblast dinamiklerini anlamamız, fibroblast koreografisinin ve dinamiklerinin cilt yaraları gibi karmaşık ortamlarda doğrudan görselleştirilmesini sağlayan ilgili testlerin bulunmaması nedeniyle üstünkörüdür. Bu yazıda, cilt yaralarının karmaşık ortamını taklit eden SCAD veya "Bir Çanakta SCar benzeri doku" kullanılarak ex-situ cilt izleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlilde, 2 mm tam kalınlıkta cilt eksize edilir ve 5 gün boyunca ortamda baş aşağı kültürlenir, bu süre zarfında yara izleri ve cilt kontraktürleri eşit olarak gelişir. Bu metodoloji, fibroblast soyuna özgü transgenik fare modelleri ile birleştiğinde, tüm yara onarım süreci boyunca bireysel fibroblast soylarının görselleştirilmesini sağlar. Genel olarak, bu protokol araştırmacıların yara onarımının temel süreçlerini ve mekanizmalarını anlamalarına, modülatörlerin yara iyileşmesi sonuçları üzerindeki etkilerini doğrudan keşfetmelerine yardımcı olur.

SCAD'lerin üretimi üç temel adıma ayrılabilir: P0-P1 farelerinden arka cildin toplanması, tam kalınlıkta biyopsi punchlarının üretilmesi ve ardından 96 kuyucuklu plakalarda 5 güne kadar bireysel scads kültürü. Bir okuma olarak, bu tahlil yara izinin mekansal ve zamansal yönlerini analiz etmek için daha fazla uygulanabilir. Uzamsal analiz, gelişmekte olan skar dokusundaki hücresel ve matris bileşenlerinin mekansal lokalizasyonunu incelemek için dokuların 2D ve 3D bağışıklık etiketlemesini kulla...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay at JoVE.com

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Bu protokol, "Bir Çanakta SCar benzeri doku" veya SCAD olarak adlandırılan bir cilt-fasya eksplantının oluşumunu tanımlar. Bu model, skar oluşumu sırasında tek fibroblastların benzeri görülmemiş bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Daha önce in vitro veya ex vivo modellerde dermal hücre bileşenleri ve cilt dokusunun karmaşıklığı yoktur. Bu ex situ SCAD testi, belirli bir sınırlamanın üstesinden gelir ve yaralı hayvanın dışındaki yara izlerinin gelişiminin incelenmesini sağlar. SCAD testi, cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünün ve skar oluşumunun görselleştirilmesini sağlar.Skar oluşumunun mekanik temelini anlamak için aktivatörlerin veya inhibitörlerin tarama kütüphanelerini sağlar. Temel süreci ve yara onarımında yer alan molekül seyrini anlamada SCAD modelini kullanan düz kütüphanelerin yüksek verimli tarama testleri. SCAD testinin cilt eksplantları kullanılarak gerçekleştirilmesi kolaydır.Tutarlı bir yara izi için, doğum sonrası sıfır gün veya birinci gün cildinin seçilmesi önerilir. Doğum sonrası sıfır veya birinci gün yenidoğan yavruyu feda ettikten sonra, iskelet kası tabakasına kadar 1.5 x 1.5 santimetre tam kalınlıktaki dorsal sırt derisini dikkatlice çıkarmak için steril bir cerrahi neşter kullanın. Steril kavisli forseps kullanarak cildi soyun ve yüzeysel fasyanın altta yatan panniculus karnoz kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.Kirletici kanı çıkarmak için eksize edilen dokuyu 50 ila 100 mililitre soğuk DMEM F-12 ortamı ile yıkayın. Ardından, doku ve hücre canlılığını korumak için dokuyu Hanks dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın. DMEM F-12 ortamı içeren 10 santimetrelik bir Petri kabında cildi yüzeysel fasyayla baş aşağı yerleştirin.Daha sonra, tek kullanımlık iki milimetrelik bir biyopsi punch kullanarak, kabuklu dokular oluşturmak için tam kalınlıkta yuvarlak deri parçalarını tüketin, yüzeysel fasyanın epidermise kadar altta yatan panniculus karnozus kası ile bozulmamış olmasını sağlayın. 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna fenol kırmızısı olmadan 200 mikrolitre taze DMEM F-12 tam ortam ekleyin. Steril forseps kullanarak, bireysel kabuklu dokuyu baş aşağı 96 delikli bir plakanın kuyularına aktarın ve tamamen batırın.Plakayı standart koşullar altında tutulan bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kültürün ikinci ve dördüncü günlerinde, kuyuda 10 mikrolitre bırakan ortamı çıkarın ve devam eden hücre ve doku canlılık koşullarını korumak için tedavi bileşikleriyle birlikte taze önceden ısıtılmış DMEM F-12 tam ortamı ekleyin. SCAD'lerin canlı görüntülenmesi için, bir mikrodalga fırında ısıtılarak bir cam şişede PBS'de 30 mililitre 2 ila% 3 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayın.Kaynattıktan sonra, şişeyi hemen aktarın ve sıvı agaroz çözeltisini 40 santigrat derecelik bir su banyosunda soğutun. Daha sonra, SCAD dokusunu fasya veya yara izi yukarı bakacak şekilde 35 milimetrelik bir kabın merkezine aktarın. Ardından, 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak 40 santigrat derece sıvı agarozu yavaşça dokuya dökerek SCAD'yi oda sıcaklığında gömün.Agarose iki dakika içinde polimerize olur. Polimerizasyondan sonra, iki mililitre önceden ısıtılmış DMEM F-12 tam ortam ekleyin. Daha sonra, makalede açıklanan uygun inkübasyon sistemleriyle donatılmış bir konfokal veya çoklu foton mikroskobu kullanarak, sıfır gününden birinci güne kadar hızlandırılmış görüntüler elde edin.Doku hasadı için, ortamı steril PBS ile değiştirerek dokuları ilgili zaman noktalarında yıkayın. Steril forseps kullanarak, dokuları gece boyunca dört santigrat derecede sabitlemek için her SCAD'yi 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ertesi gün, metin yazısında açıklandığı gibi iki veya üç boyutlu immünofloresan boyamaya geçmeden önce dokuları PBS ile üç kez yıkayın.SCAD'lerin sıfır ve beşinci günlerdeki temsili tam montajlı parlak alan görüntüleri burada gösterilmektedir. Masson'un dikey doku kesitlerini trikrom boyaması, sıfır ve beş günlerinde skar çekirdeğinde doku skarlaşması, doku kasılması ve hücre dışı matriks birikiminin imzalarını ortaya koymaktadır. SCAD'lerin sıfır ve beş günlerinde immünofloresan boyaması gösterilmiştir.Erken ve geç evre skardan, kökleşmiş pozitif fibroblast yeşil ve kökleşmiş negatif fibroblast kırmızı renkte gösterilir. Üç boyutlu görüntüleme için, dokular agaroz çözeltisine gömüldü ve PBSGT ile kaplandı. Temsili görüntüler, N-kadherin proteininin beş günlük SCAD'nin skar bölgesinde özel lokalizasyonunu göstermektedir.Bir inkübasyon odası ile donatılmış üç boyutlu hızlandırılmış görüntüleme kurulumu, fibroblast sürülerinin ilk 12 saat boyunca veya skar gelişiminin erken aşamalarında ilerlemesinin erken olaylarını gösterdi. Bireysel fibroblastların skar gelişimi üzerindeki tek hücreli izlenen hücresel yörüngelerinin grafiksel gösterimi burada sunulmuştur. SCAD dokusunu kuyu plakasının içine baş aşağı yerleştirmek çok önemlidir, böylece fasyanın yukarı bakması sağlanır.Bunun yapılmaması, geçiş modellerinde kaçınılmaz değişikliklere neden olur. Bu prosedür, kimyasal modülatörler, nötralize edici antikorlar veya viral yöntemler kullanarak tedaviler veya kültür için dermal tabakaların incelenmesine izin verir. Bu, çeşitli tıbbi ortamlarda patolojik fibrotik yanıtların değerlendirilmesinde yardımcı olur.Konneksin-43 ve N-kadherinin ekspresyonunu, yaralama üzerine fasya mobilizasyonunda rol oynayan anahtar moleküller olarak gösterdik. SCAD metodolojisi, skarlaşmayı ve fibrozu azaltmak için yeni terapötik stratejilerin tanımlanmasına izin verir.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...