Name: production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

J.G.E.Y a reçu une bourse de doctorat du Collège vétérinaire de l’Ontario et une bourse d’études supérieures de l’Ontario. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada à SKW (subvention no 304737) et LS (subvention no 401127).

Tous les travaux impliquant l’utilisation d’animaux ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de l’Université de Guelph conformément au Conseil canadien sur les soins aux animaux. Tous les travaux sont effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) au Canada où le VND mésogénique est un agent pathogène du groupe de risque 2. Toutes les étapes impliquées dans l’amplification et la purification du NDV doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique de ...

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Les virus utilisés comme agents thérapeutiques dans les études précliniques doivent être hautement purifiés pour éviter toute toxicité lorsqu’ils sont administrés in vivo15. Si les agents adventices ou les contaminants ne sont pas éliminés, cela peut entraîner des effets indésirables graves annulant l’effet thérapeutique de l’agent viral28. Comme le NDV est produit dans les œufs de poule embryonnés, il existe plusieurs protéines d’œuf cont...

Le virus de la maladie de Newcastle, également connu sous le nom d’orthoavulavirus aviaire-1, est un paramyxovirus aviaire enveloppé susceptible d’être utilisé à la fois comme virus oncolytique ou comme vaccin à vecteur viral 1,2,3,4,5,6,7. Plus récemment, le NDV conçu pour exprimer la protéine de pointe du SARS-CoV-2 a été caractérisé comme un vaccin intranasal efficace dans les modèlesde provocation de souris et de hamster 7,8,9. Lorsqu’il est utilisé comme immunothérapie du cancer, il entraîne le recrutement de cellules immunitaires innées, en particulier les cellules tueuses naturelles, la production d’interféron de type I et la génération de cellules T antitumorales spécifiques 10,11,12,13. En plus de ces puissantes propriétés immunostimulantes, le NDV a un profil d’innocuité solide et un système de génétique inverse bien établi14,15. Ces caractéristiques souhaitables ont incité à l’évaluation du VND dans de nombreux essais cliniques précliniques et humains (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Pour faire progresser ce vecteur viral immunostimulant très prometteur, des méthodes détaillées sont nécessaires pour produire et purifier le VND ultra-pur à titre élevé qui peut être administré en toute sécurité in vivo.
Comme le NDV est un paramyxovirus aviaire, il est le plus souvent amplifié dans les œufs de poule embryonnés. Bien qu’il existe des systèmes cellulaires disponibles pour la propagation du VND, la plupart n’ont pas été en mesure de produire des titres similaires à ceux obtenus dans les œufs de poule embryonnés18. Néanmoins, la production de NDV dans les œufs présente certains inconvénients, notamment le fait que la production à base d’œufs est longue et difficilement évolutive, que l’approvisionnement en grandes quantités d’œufs de poule SPF peut être problématique et qu’il existe un risque de contamination par des allergènes d’œufs 13,18,19,20 . Récemment, un groupe a montré que les cellules Vero cultivées en suspension dans un milieu sans sérum peuvent soutenir la réplication du NDV sur des titres comparables à ceux obtenus dans les œufs, avant la purification21. Cependant, cela nécessitait un passage en série du virus pour adapter le virus aux cellules Vero, et l’optimisation d’une méthode pour purifier le NDV des cellules Vero en suspension est toujours nécessaire21.
Comme nous l’avons souligné précédemment, les méthodes utilisées pour purifier le virus in vivo à titre élevé varient en fonction du virus en question22. Il existe un système de génétique inverse bien établi disponible pour la génération de NDV recombinant. Ce processus, impliquant l’utilisation d’un clone d’ADNc, de plasmides auxiliaires et d’un virus auxiliaire exprimant l’ARN polymérase T7, a déjà été décrit en détail15,23. Ce protocole peut être appliqué au VND lentogène ou mésogénique. Le virus décrit dans ce protocole est un NDV mésogénique recombinant codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria insérée entre les gènes viraux P et M en tant qu’unité de transcription individuelle, car celle-ci a déjà été décrite comme le site optimal pour l’insertion de transgène étranger24.
Les méthodes ci-jointes décrivent la purification du NDV en fonction de sa taille, allant de 100 à 500 nm, et de sa densitéde 15. Cela a permis la génération de stocks de NDV de qualité in vivo et à titre élevé en environ 3 semaines, à partir du moment où les œufs sont reçus jusqu’à la fin du titre. Les techniques fréquemment utilisées dans la production à grande échelle de virus à base d’œufs telles que la filtration à flux tangentiel, la filtration en profondeur et l’ultracentrifugation par gradient de densité sont décrites, permettant la traduction de ces méthodes à une production à plus grande échelle. Les techniques décrites précédemment pour la purification du VND ont été améliorées par l’incorporation d’un tampon stabilisant le virus, l’utilisation de l’iodixanol lors de l’ultracentrifugation du gradient de densité et la description de diverses mesures de contrôle de la qualité pour assurer une qualité in vivo de qualité 15. Cela a permis de purifier le NDV in vivo atteignant des titres allant jusqu’à 3 × 1010 PFU/mL de 0,8 à 1,0 L de liquide allantoïque.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Slip-Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Povidone Iodine Solution</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14955240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 5/8 in Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>03446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde-PBS</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-14 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (5%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>36-102-0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad, unserrated tipped forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Cassette Holder</td>
			<td>PALL</td>
			<td>CM018V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP101-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet Gel Recovery</td>
			<td>ClearH2O, INC</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>1502W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Candler</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>A46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP82031GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06349-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>ZEISS AXIO</td>
			<td></td>
			<td>Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GiBOX Gel Imager</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td>Imaging of Agarose Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose Dulbecco&#39;s Modified Essential Medium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Kit</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine Monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62929-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>41507-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07522-20</td>
			<td>Peristaltic Pump with digital display</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96420-16</td>
			<td>BioPharm Platinum-Cured Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC Pro 5 Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP950040025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td>SDS-PAGE cast and running appartus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-NDV</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-11633</td>
			<td>Clone 6H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OS100T02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowePac 300</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>50999562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (Pellets)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S318-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific pathogen free eggs</td>
			<td>CFIA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Supplier will vary depending on location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supracap 50 Depth Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>SC050V100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sw41Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SX4750 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>359472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Screw Clamp</td>
			<td>PALL</td>
			<td>88216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utility Pressure Gauges</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>68355-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid

Le virus de la maladie de Newcastle (NDV), également connu sous le nom de sérotype 1 de l’orthoavulavirus aviaire, est un virus à ARN simple brin à sens négatif qui a été développé à la fois comme virus oncolytique et comme vaccin à vecteur viral. Le NDV est un agent thérapeutique et prophylactique attrayant en raison de son système génétique inverse bien établi, de ses puissantes propriétés immunostimulantes et de son excellent profil d’innocuité. Lorsqu’il est administré sous forme de virus oncolytique ou de vaccin à vecteur viral, le NDV provoque une réponse immunitaire robuste antitumorale ou spécifique à l’antigène, activant à la fois les bras innés et adaptatifs du système immunitaire. 
Compte tenu de ces caractéristiques souhaitables, le NDV a été évalué dans de nombreux essais cliniques et est l’un des virus oncolytiques les plus étudiés. À l’heure actuelle, deux essais cliniques enregistrés portant sur le NDV sont menés : l’un évaluant un vaccin recombinant à vecteur NDV pour le SARS-CoV-2 (NCT04871737) et l’autre évaluant un NDV recombinant codant pour l’interleukine-12 en association avec Durvalumab, un anticorps antiPD-L1 (NCT04613492). Pour faciliter l’avancement de ce vecteur viral très prometteur, des méthodes simplifiées pour générer du VND (VND) recombinant (RNDV) à titre in vivo à haute teneur sont nécessaires. 
Cet article décrit une procédure détaillée pour amplifier le rNDV dans des œufs de poule embryonnés sans agent pathogène spécifié (FPS) et purifier le rNDV du liquide allantoïque, avec des améliorations pour réduire les pertes pendant la purification. Sont également incluses des descriptions des tests de contrôle de la qualité recommandés, qui devraient être effectués pour confirmer l’absence de contaminants et l’intégrité du virus. Dans l’ensemble, cette procédure détaillée permet la synthèse, la purification et le stockage de NDV à haute teneur , in vivo, recombinant, lentogène et mésogénique pour une utilisation dans des études précliniques.

Récolte du liquide allantoïque Comme le liquide allantoïque est récolté à partir d’œufs de poule embryonnés, il devrait sembler clair et transparent. Si le fluide semble opaque et jaune, cela indique la présence de contaminants. L’inclusion de ce fluide allantoïque pendant la purification entravera le processus de purification, car la pression augmentera rapidement et dépassera 10 psi, entraînant le cisaillement du virus et la perte du virus infectieux. Le liquide allantoïque qui semb...

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Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement > 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.

Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour produire le virus de la maladie de Newcastle afin qu’il puisse être administré en toute sécurité aux souris et à d’autres animaux tels que les hamsters et les moutons. L’utilisation de la filtration à flux tangentiel permet de traiter plus efficacement de grands volumes de départ par rapport aux procédures existantes qui n’utilisent que des procédés de centrifugation. Il s’agit d’une longue procédure impliquant plusieurs étapes complexes, ce qui signifie que la gestion du temps peut être un problème.Je recommanderais d’identifier toutes les étapes de pause potentielles afin que la technique puisse être divisée de manière appropriée, minimisant ainsi le stress. Alex, un assistant de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour la purification du virus de la maladie de Newcastle ou NDV, commencez par amorcer le système expérimental précédemment défini en y faisant passer 50 millilitres de PBS.Arrêtez la pompe lorsqu’environ cinq millilitres de PBS sont laissés dans le tube. Ensuite, fixez un filtre de profondeur avec un indice de rétention micromolaire de un à trois sur le tube. Pour évacuer le filtre, retirez le deuxième bouchon du côté épique du filtre de profondeur, puis commencez à faire passer 50 millilitres supplémentaires de PBS dans le système.Une fois que le PBS commence à circuler à travers l’évent situé en haut du filtre, fermez le port et continuez à faire circuler le PBS à travers les lignes. Après cela, remplacez le récipient à déchets par un nouveau récipient de collecte stérile et commencez à faire passer le fluide allantoïque à travers le filtre de profondeur. Ensuite, configurez le système de filtration à flux tangentiel ou TFF dans une confirmation ouverte et exécutez-le comme décrit dans le manuscrit.Lorsqu’il reste environ cinq millilitres de fluide dans le réservoir, mettez la pompe en pause et ajoutez du liquide allantoïque filtré en profondeur au réservoir. Reprenez ensuite le débit de la pompe. Pour éviter le cisaillement du virus, il est important de s’assurer que la pression du système ne dépasse pas 10 livres de force par pouce carré.Pour augmenter l’illusion, une combinaison de la vitesse de la pompe péristaltique et de la pince C doit être utilisée. 150 à 100 millilitres de liquide allantoïque sont laissés dans le réservoir, mettent la pompe en pause et échangent le tampon en ajoutant 150 à 200 millilitres de tampon ML. Encore une fois, mettez la pompe en pause lorsque cinq à 10 millilitres de liquide sont laissés dans le réservoir, puis en utilisant deux pinces C, fermez la taille.Découplez la ligne rétendue alimentant le réservoir et insérez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, reprenez l’écoulement et faites une pause lorsqu’il reste quelques gouttes de liquide dans le réservoir du réservoir. Ensuite, retirez les pinces C des conduites de déchets et rattachez la conduite d’alimentation en place au réservoir du réservoir.Pendant ce temps, pour se préparer à l’ultracentrifugation du gradient de densité de l’iodixanol, ajoutez d’abord un 0,5 millilitre de 40% d’iodixanol à un tube ultra centrifugeuse à paroi mince à toit ouvert de 13,2 millilitres. Ensuite, préparez la colonne avec des ajouts successifs de 2,5 millilitres de 20% d’iodixanol et de 2,5 millilitres de 10% d’iodixanol. Avant l’ultracentrifugation, ajoutez soigneusement six à 6,5 millilitres de la solution virale évoquée du système TFF à la colonne d’iodixanol sans perturber le gradient.Après ultracentrifugation, retirez les tubes avec une paire de pinces stériles. La bande cible doit être une grande bande entre les gradients de 10 et 20 %. Ensuite, suspendez le tube sur le dessus d’un bécher à l’aide d’un support d’autoclave.Après cela, attachez une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 à une seringue de cinq millilitres, puis perforez le côté du tube d’ultracentrifugation avec l’aiguille et retirez la bande cible en étendant lentement le piston. Après avoir retiré l’iodixanol de la solution virale décrite dans le manuscrit, utilisez une seringue pour injecter soigneusement le virus dans une cassette de dialyse. Pour concentrer la solution virale, retirez la cassette de dialyse du tampon de dialyse et placez-la dans un petit sac en plastique scellable.Ajoutez ensuite 15 à 25 millilitres de polyéthylène glycol à 40% dans le sac afin que la cassette de dialyse soit complètement immergée. Après la dialyse, rincez brièvement la cassette de dialyse avec du PBS. Ensuite, remplissez une seringue équipée d’une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 avec de l’air, insérez la seringue dans la cassette de dialyse et poussez le piston.Faites pivoter l’appareil pour éliminer le virus sans retirer l’air introduit. Pour déloger le virus résiduel adhérant à la membrane, massez soigneusement la membrane avec des doigts gantés sans l’endommager. Pour faciliter le processus de délogement, retirez une partie de l’excès d’air dans la cassette de dialyse.Pour les tests de contrôle de la qualité, diluez d’abord la solution virale 100 fois en ajoutant 10 microlitres à 990 microlitres de PBS dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, continuez la dilution en série en ajoutant 100 microlitres de la dilution précédente à 900 microlitres de PBS. Pour les tests d’infection, ajoutez 20 microlitres de chaque illusion à chaque puits d’une plaque de 96 puits.Avant d’examiner l’effet cytopathique de la protéine de fluorescence verte, ou d’effectuer un test d’immunofluorescence indirecte, incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 48 heures. En utilisant ce protocole, le NDV hautement purifié a été obtenu, comme l’a démontré l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de sulfate de sodium des protéines virales. L’infectiosité du virus purifié par cette méthode a également été vérifiée par la dose d’infection par culture tissulaire de 50% ou le test TCID50 effectué dans 96 plaques de puits.Le TCID50 a été déterminé à partir du nombre de puits positifs pour chaque dilution à l’aide du calculateur Spearman-Karber. Le test d’infection a révélé la différence entre les effets cytopathiques du VND lentogène et mésogénique sur les cellules DF one dans différentes conditions après 10 et 24 heures d’incubation. Le test immuno florence s’est également avéré efficace pour étudier l’infection des cellules Vero par le VND lentogène.Lors de l’amorçage du système expérimental, assurez-vous que les lignées sont amorcées efficacement, car tout hydroxyde de sodium résiduel inactivera le virus. Il est également important de maintenir l’intégrité de la membrane, car compromettre cela nuira considérablement à la purification et au rendement du virus.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Un modèle murin de xénogreffe d’Ommaya pour étudier le traitement ciblé direct de la maladie leptoméningée

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...