Name: production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

J.G.E.Y erhielt ein PhD-Stipendium des Ontario Veterinary College und ein Ontario Graduate Scholarship. Diese Arbeit wurde durch Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants an SKW (Grant # 304737) und LS (Grant # 401127) finanziert.

Alle Arbeiten, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom University of Guelph Animal Care Committee in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care genehmigt. Alle Arbeiten werden in einem Labor für BioSafety Level 2 (BSL2) in Kanada durchgeführt, in dem mesogene NDV ein Erreger der Risikogruppe 2 ist. Alle Schritte zur Amplifikation und Reinigung von NDV sollten aus Sicherheits- und Sterilitätsgründen in einer biologischen Sicherheitswerkbank vom Typ IIA durchgeführt werden.
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Viren, die in präklinischen Studien als Therapeutika verwendet werden, müssen bei der Verabreichung in vivo15 stark gereinigt werden, um Toxizität zu vermeiden. Wenn zufällige Agenzien oder Verunreinigungen nicht entfernt werden, kann dies zu schweren Nebenwirkungen führen, die die therapeutische Wirkung des viralen Wirkstoffszunichte machen 28. Da NDV in embryonierten Hühnereiern hergestellt wird, gibt es mehrere kontaminierende Eiproteine wie Eieralbumin, d...

Newcastle Disease Virus, auch bekannt als Avian Orthoavulavirus-1, ist ein umhülltes aviäres Paramyxovirus mit dem Potenzial, sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff 1,2,3,4,5,6,7 verwendet zu werden. In jüngster Zeit wurde NDV, das zur Expression des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 entwickelt wurde, als wirksamer intranasales Impfstoff in den Maus- und Hamster-Challenge-Modellen 7,8,9 charakterisiert. Wenn es als Krebsimmuntherapie verwendet wird, führt es zur Rekrutierung angeborener Immunzellen, insbesondere natürlicher Killerzellen, zur Produktion von Typ-I-Interferon und zur Erzeugung von antitumorspezifischen T-Zellen10,11,12,13. Zusätzlich zu diesen starken immunstimulierenden Eigenschaften hat NDV ein starkes Sicherheitsprofil und ein gut etabliertes umgekehrtes Genetiksystem14,15. Diese wünschenswerten Eigenschaften haben zur Bewertung von NDV in zahlreichen präklinischen und humanklinischen Studien geführt (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Um diesen vielversprechenden, immunstimulierenden viralen Vektor weiter voranzubringen, sind detaillierte Methoden zur Herstellung und Reinigung von hochtiterem, hochreinem NDV erforderlich, das sicher in vivo verabreicht werden kann.
Da NDV ein Vogelparamyxovirus ist, wird es am häufigsten in embryonierten Hühnereiern amplifiziert. Während es zellbasierte Systeme zur Vermehrung von NDV gibt, waren die meisten nicht in der Lage, Titer zu produzieren, die denen ähneln, die in embryonierten Hühnereiern18 erreicht wurden. Dennoch gibt es einige Nachteile bei der Herstellung von NDV in Eiern, einschließlich der Tatsache, dass die Produktion auf Eibasis langwierig und nicht leicht skalierbar ist, die Beschaffung großer Mengen von SPF-Hühnereiern problematisch sein kann und das Potenzial für eine Kontamination mit Eiallergenen besteht13,18,19,20 . Kürzlich hat eine Gruppe gezeigt, dass Vero-Zellen, die in Suspension in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, die Replikation von NDV zu Titern unterstützen können, die mit denen vergleichbar sind, die in Eiern vor der Reinigungerreicht wurden 21. Dies erforderte jedoch eine serielle Übertragung des Virus, um das Virus an Vero-Zellen anzupassen, und die Optimierung einer Methode zur Reinigung von NDV aus Suspensions-Vero-Zellen ist immer noch erforderlich21.
Wie bereits erwähnt, variieren die Methoden zur Reinigung von High-Titer-In-vivo-Viren je nach dem betreffenden Virus22. Für die Erzeugung rekombinanter NDV steht ein gut etabliertes System der umgekehrten Genetik zur Verfügung. Dieser Prozess, bei dem ein cDNA-Klon, Helferplasmide und ein Helfervirus verwendet werden, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, wurde zuvor ausführlich beschrieben 15,23. Dieses Protokoll kann entweder auf lentogene oder mesogene NDV angewendet werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Virus ist ein rekombinantes mesogenes NDV, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria kodiert, das zwischen viralen P- und M-Genen als individuelle Transkriptionseinheit eingefügt wurde, da dies zuvor als optimaler Ort für die Insertion von Fremdtransgenen beschrieben wurde24.
Geschlossene Methoden beschreiben die Reinigung von NDV basierend auf seiner Größe, die von 100 bis 500 nm reicht, und seiner Dichte15. Dies ermöglichte die Erzeugung von In-vivo-haltigen, hochtiteren NDV-Beständen in etwa 3 Wochen, beginnend mit dem Empfang der Eier bis hin zu einem endgültigen Titer. Es werden Techniken beschrieben, die häufig bei der großtechnischen Produktion von Viren auf Eibasis verwendet werden, wie z. B. Tangentialflussfiltration, Tiefenfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, die die Übertragung dieser Methoden auf die Produktion in größerem Maßstab ermöglichen. Zuvor beschriebene Techniken zur Reinigung von NDV wurden durch den Einbau eines virusstabilisierenden Puffers, die Verwendung von Iodixanol während der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die Beschreibung verschiedener Qualitätskontrollmaßnahmen zur Sicherstellung der In-vivo-Qualität verbessert 15. Dies hat die Reinigung von In-vivo-Qualität NDV ermöglicht, die Titer von bis zu 3 × 1010 PFU / ml von 0,8 bis 1,0 L Allantoikflüssigkeit erreicht.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Slip-Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Povidone Iodine Solution</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14955240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 5/8 in Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>03446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde-PBS</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-14 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (5%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>36-102-0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad, unserrated tipped forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Cassette Holder</td>
			<td>PALL</td>
			<td>CM018V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP101-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet Gel Recovery</td>
			<td>ClearH2O, INC</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>1502W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Candler</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>A46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP82031GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06349-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>ZEISS AXIO</td>
			<td></td>
			<td>Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GiBOX Gel Imager</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td>Imaging of Agarose Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose Dulbecco&#39;s Modified Essential Medium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Kit</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine Monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62929-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>41507-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07522-20</td>
			<td>Peristaltic Pump with digital display</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96420-16</td>
			<td>BioPharm Platinum-Cured Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC Pro 5 Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP950040025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td>SDS-PAGE cast and running appartus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-NDV</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-11633</td>
			<td>Clone 6H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OS100T02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowePac 300</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>50999562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (Pellets)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S318-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific pathogen free eggs</td>
			<td>CFIA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Supplier will vary depending on location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supracap 50 Depth Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>SC050V100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sw41Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SX4750 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>359472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Screw Clamp</td>
			<td>PALL</td>
			<td>88216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utility Pressure Gauges</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>68355-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid

Das Newcastle-Disease-Virus (NDV), auch bekannt als Vogelorthoavulavirus-Serotyp-1, ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit negativem Sinn, das sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff entwickelt wurde. NDV ist aufgrund seines gut etablierten reverse-genetischen Systems, seiner starken immunstimulierenden Eigenschaften und seines ausgezeichneten Sicherheitsprofils ein attraktives therapeutisches und prophylaktisches Mittel. Bei der Verabreichung als onkolytisches Virus oder viral-vektorisierter Impfstoff löst NDV eine robuste Antitumor- oder Antigen-spezifische Immunantwort aus, die sowohl den angeborenen als auch den adaptiven Arm des Immunsystems aktiviert. 
Angesichts dieser wünschenswerten Eigenschaften wurde NDV in zahlreichen klinischen Studien untersucht und ist eines der am besten untersuchten onkolytischen Viren. Derzeit gibt es zwei registrierte klinische Studien mit NDV: eine zur Bewertung eines rekombinanten NDV-vektorisierten Impfstoffs für SARS-CoV-2 (NCT04871737) und eine zweite zur Bewertung eines rekombinanten NDV, das Interleukin-12 kodiert, in Kombination mit Durvalumab, einem AntiPD-L1-Antikörper (NCT04613492). Um die Weiterentwicklung dieses vielversprechenden viralen Vektors zu erleichtern, sind vereinfachte Methoden zur Erzeugung von rekombinantem NDV (rNDV) mit hohem Titer-, In-vivo-Grad erforderlich. 
Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Amplifikation von rNDV in spezifizierten pathogenfreien (SPF) embryonierten Hühnereiern und zur Reinigung von rNDV aus Allantoikflüssigkeit mit Verbesserungen zur Verringerung des Verlusts während der Reinigung. Ebenfalls enthalten sind Beschreibungen der empfohlenen Qualitätskontrollassays, die durchgeführt werden sollten, um den Mangel an Kontaminanten und die Virusintegrität zu bestätigen. Insgesamt ermöglicht dieses detaillierte Verfahren die Synthese, Reinigung und Speicherung von hochtiteren, in vivo gradigen, rekombinanten, lentogen und mesogenen NDV für den Einsatz in präklinischen Studien.

Ernte von Allantoikflüssigkeit Da Allantoikflüssigkeit aus embryonierten Hühnereiern gewonnen wird, sollte sie klar und transparent erscheinen. Wenn die Flüssigkeit undurchsichtig und gelb erscheint, deutet dies auf das Vorhandensein von Verunreinigungen hin. Die Einbeziehung dieser allantoischen Flüssigkeit während der Reinigung behindert den Reinigungsprozess, da der Druck schnell ansteigt und 10 psi überschreitet, was zur Scherung des Virus und zum Verlust des infektiösen Virus führt. Alla...

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Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg > 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Dieses Protokoll beschreibt die Techniken, die zur Herstellung des Newcastle-Disease-Virus verwendet werden, damit es Mäusen und anderen Tieren wie Hamstern und Schafen sicher verabreicht werden kann. Durch den Einsatz der tangentialen Strömungsfiltration können große Startvolumina im Vergleich zu bestehenden Verfahren, die nur Zentrifugationsverfahren verwenden, effizienter verarbeitet werden. Dies ist ein langwieriges Verfahren mit mehreren komplizierten Schritten, was bedeutet, dass das Zeitmanagement ein Problem sein kann.Ich würde empfehlen, alle potenziellen Pausenschritte zu identifizieren, damit die Technik angemessen aufgeteilt werden kann, wodurch der Stress minimiert wird. Dieses Verfahren wird Alex, ein Forschungsassistent aus meinem Labor, demonstrieren. Für die Reinigung des Newcastle Disease Virus oder NDV bereiten Sie zunächst das zuvor festgelegte experimentelle System vor, indem Sie 50 Milliliter PBS durchlaufen.Stoppen Sie die Pumpe, wenn etwa fünf Milliliter PBS im Rohr verbleiben. Als nächstes befestigen Sie einen Tiefenfilter mit einer mikromolaren Retentionsrate von ein bis drei an den Schläuchen. Um den Filter zu entlüften, entfernen Sie die zweite Kappe auf der epischen Seite des Tiefenfilters und beginnen Sie dann, zusätzliche 50 Milliliter PBS durch das System laufen zu lassen.Sobald der PBS beginnt, durch die Entlüftung an der Oberseite des Filters zu fließen, schließen Sie den Anschluss und fahren Sie fort, PBS durch die Leitungen zu fließen. Danach ersetzen Sie das Abfallgefäß durch ein neues steriles Sammelgefäß und beginnen Sie, Allantoic Fluid durch den Tiefenfilter zu führen. Als nächstes richten Sie die tangentiale Strömungsfiltration oder das TFF-System in einer offenen Bestätigung ein und führen Sie sie wie im Manuskript beschrieben aus.Wenn sich noch etwa fünf Milliliter Flüssigkeit im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe und fügen Sie dem Reservoir tiefengefilterte Allantoic Fluid hinzu. Nehmen Sie dann den Pumpendurchfluss wieder auf. Um das Scheren des Virus zu verhindern, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Druck des Systems 10 Pfund Kraft pro Quadratzoll nicht überschreitet.Um die Illusion zu erhöhen, sollte eine Kombination aus der Drehzahl der Peristaltikpumpe und der C-Klemme verwendet werden. 150 bis 100 Milliliter Allantoic Fluid verbleiben im Reservoir, pausieren Sie die Pumpe und tauschen Sie den Puffer durch Zugabe von 150 bis 200 Milliliter ML-Puffer aus. Halten Sie die Pumpe erneut an, wenn fünf bis 10 Milliliter Flüssigkeit im Reservoir verbleiben, und schließen Sie dann mit zwei C-Klemmen die Taille.Entkoppeln Sie die festsitzende Leitung, die den Behälter speist, und führen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konusrohr ein. Nehmen Sie dann den Fluss wieder auf und pausieren Sie, wenn nur noch wenige Flüssigkeitstropfen im Reservoirtank vorhanden sind. Entfernen Sie als Nächstes die C-Klemmen von den Abfallleitungen und befestigen Sie die zurückgehaltene Zuleitung wieder am Reservoirtank.Um sich auf die Ultrazentrifugation des Iodixanol-Dichtegradienten vorzubereiten, fügen Sie zunächst 0,5 Milliliter 40% iodixanol zu einem 13,2 Milliliter offenen dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchen hinzu. Dann machen Sie die Säule mit aufeinanderfolgenden Zugaben von 2,5 Millilitern 20% Jodixanol und 2,5 Millilitern 10% Iodixanol fertig. Vor der Ultrazentrifugation sechs bis 6,5 Milliliter der aus dem TFF-System angedeuteten Viruslösung vorsichtig in die Iodixanol-Säule geben, ohne den Gradienten zu stören.Entfernen Sie nach der Ultrazentrifugation die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Das Zielband sollte ein großes Band zwischen den Gradienten von 10 und 20% sein. Als nächstes hängen Sie das Rohr mit einem Retortenständer über die Oberseite eines Becherglases.Danach befestigen Sie eine 1,5-Zoll-Nadel von 18 Gauge an einer Fünf-Milliliter-Spritze, durchstechen Sie dann die Seite des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel und entfernen Sie das Zielband, indem Sie den Kolben langsam verlängern. Nachdem Sie Iodixanol aus der Viruslösung entfernt haben, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie eine Spritze, um das Virus vorsichtig in eine Dialysekassette zu injizieren. Um die Viruslösung zu konzentrieren, nehmen Sie die Dialysekassette aus dem Dialysepuffer und legen Sie sie in einen kleinen verschließbaren Plastikbeutel.Dann geben Sie einen 15 bis 25 Milliliter 40% Polyethylenglykol in den Beutel, so dass die Dialysekassette vollständig untergetaucht ist. Nach der Dialyse die Dialysekassette kurz mit PBS abspülen. Als nächstes füllen Sie eine Spritze, die mit einer 1,5-Zoll-Nadel von 18 Gauge ausgestattet ist, mit Luft, setzen Sie die Spritze in die Dialysekassette ein und drücken Sie den Kolben.Drehen Sie das Gerät zum Entfernen des Virus, ohne die eingebrachte Luft zu entfernen. Um das an der Membran haftende Restvirus zu entfernen, massieren Sie die Membran vorsichtig mit behandschuhten Fingern, ohne sie zu beschädigen. Um den Verdrängungsprozess zu erleichtern, entfernen Sie einen Teil der überschüssigen Luft in der Dialysekassette.Für Qualitätskontrollassays verdünnen Sie zunächst die Viruslösung 100 Mal, indem Sie 10 Mikroliter davon zu 990 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Fahren Sie dann mit der seriellen Verdünnung fort, indem Sie 100 Mikroliter der vorherigen Verdünnung zu 900 Mikrolitern PBS hinzufügen. Für Infektionsassays fügen Sie 20 Mikroliter jeder Wahnvorstellung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu.Bevor Sie die zytopathische Wirkung von grünem Fluoreszenzprotein untersuchen oder einen indirekten Immunfluoreszenztest durchführen, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für mindestens 48 Stunden. Durch die Verwendung dieses Protokolls wurde hochgereinigtes NDV erhalten, wie durch Natrium-Do-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der viralen Proteine gezeigt wurde. Die Infektiosität des mit dieser Methode gereinigten Virus wurde auch durch die 50%ige Gewebekulturinfektionsdosis oder den TCID50-Assay in 96 Well-Platten verifiziert.Der TCID50 wurde aus der Anzahl der positiven Vertiefungen für jede Verdünnung mit dem Spearman-Karber-Rechner bestimmt. Der Infektionsassay zeigte den Unterschied zwischen den zytopathischen Wirkungen von lentogener und mesogener NDV auf DF-Ein-Zellen unter verschiedenen Bedingungen nach 10 und 24 Stunden Inkubation. Der Immun-Florence-Assay war auch wirksam bei der Untersuchung der Infektion von Vero-Zellen durch lentogene NDV.Stellen Sie bei der Grundierung des experimentellen Systems sicher, dass die Linien effektiv vorbereitet werden, da jedes verbleibende Natriumhydroxid das Virus inaktiviert. Es ist auch wichtig, die Integrität der Membran aufrechtzuerhalten, da dies die Virusreinigung und -ausbeute erheblich beeinträchtigt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Forschung

Krebsforschung

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Ein murines Ommaya Xenograft-Modell zur Untersuchung der direkten zielgerichteten Therapie von Leptomeningealerkrankungen

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...