Name: production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

J.G.E.Y는 온타리오 수의과 대학 박사 장학금과 온타리오 대학원 장학금을 받았습니다. 이 연구는 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구위원회가 SKW (보조금 # 304737) 및 LS (보조금 # 401127)에 자금을 지원했습니다.

동물 사용과 관련된 모든 작업은 캐나다 동물 관리위원회에 따라 구엘프 대학 동물 관리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 작업은 캐나다의 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행되며, 메소제닉 NDV는 위험 그룹 2 병원체입니다. NDV의 증폭 및 정제에 관여하는 모든 단계는 안전성 및 멸균 목적을 위해 유형 IIA 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 한다.
1. 특정 병원균이...

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	<li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li><li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector.">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li><li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+paramyxoviruses:+mechanism+of+action,+preclinical+and+clinical+studies.">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li><li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV):+brief+history+of+its+oncolytic+strains.">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li><li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer.">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li><li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models.">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li><li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease.">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219 (2021).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV)+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate.">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Newcastle+disease+virus+(NDV)+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine.">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo.">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li><li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy.">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li><li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy.">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li><li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li><li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+therapy+resistance:+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy.">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li><li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer.">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li><li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate.">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li><li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus:+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations.">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li><li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor.">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification.">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li><li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+influenza+vaccines:+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future.">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li><li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures.">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).</li><li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic:+clinical-grade+production,+purification,+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses.">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 3, 16018 (2016).</li><li>Ayllon, J., Garc&#237;a-Sastre, A., Mart&#237;nez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA.">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).</li><li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression.">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, 40-45 (2015).</li><li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy.">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).</li><li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ulster+strain+Newcastle+disease+virus+hemagglutinin-neuraminidase+reveals+auto-inhibitory+interactions+associated+with+low+virulence.">Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).</li><li>Sheets, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+on+adventitious+agents+testing+for+vaccines:+Why+do+we+worry+so+much+about+adventitious+agents+in+vaccines.">Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines.</a> Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).</li><li>Chung, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+allergies.">Vaccine allergies.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).</li><li>Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+years+of+clinical+application+of+Newcastle+disease+virus:+time+to+celebrate.">Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate.</a> Biomedicines. 4 (3), (2016).</li><li>Ajamian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL5+persists+in+RSV+stocks+following+sucrose-gradient+purification.">CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).</li><li>Axis-Shield. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).</li><li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+(OptiPrep)-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations.">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li><li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient.">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation.">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li><li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector:+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication.">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy.">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li><li>Chen, T. -. F., Jang, J. -. W., Miller, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STABLE+AND+FILTERABLE+ENVELOPED+VIRUS+FORMULATIONS+STABILE+UND+FILTERBARE+EINGEH&#220;LLTE+VIRUSFORMULIERUNGEN+FORMULATIONS+DE+VIRUS+ENVELOPP&#201;S+FILTRABLES+ET+STABLES+(84).">STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEH&#220;LLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPP&#201;S FILTRABLES ET STABLES (84).</a> EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , 1-14 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity.">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).</li></ol>

전임상 연구에서 치료제로 사용되는 바이러스는 생체내15 투여시 독성을 피하기 위해 고도로 정제되어야 한다. 우발적인 제제 또는 오염물질이 제거되지 않으면, 이것은 바이러스제(28)의 치료 효과를 부정하는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. NDV는 배아 닭 난자에서 생산되기 때문에 난알부민과 같은 몇 가지 오염 된 난자 단백질이 전임상 또는 임상 모...

뉴캐슬병 바이러스는 조류 오르토아불라바이러스-1로도 알려져 있으며, 종양 용해 바이러스 또는 바이러스 벡터 백신 1,2,3,4,5,6,7로 사용될 가능성이 있는 외피형 조류 파라믹소바이러스이다. 가장 최근에, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 발현하도록 조작된 NDV는 마우스 및 햄스터 챌린지 모델7,8,9에서 효과적인 비내 백신으로 특성화되었다. 암 면역요법으로 사용될 때, 선천적 면역 세포, 특히 자연 살해 세포의 모집, 타입 I 인터페론의 생산, 및 항종양 특이적 T 세포10,11,12,13의 생성을 초래한다. 이러한 강력한 면역자극 특성 외에도, NDV는 강력한 안전성 프로파일과 잘 확립된 역유전학 시스템(14,15)을 갖는다. 이러한 바람직한 특성은 수많은 전임상 및 인간 임상 시험 (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17에서 NDV의 평가를 촉발시켰다. 이 매우 유망하고 면역자극성 바이러스 벡터를 더욱 발전시키기 위해서는 생체내에서 안전하게 투여될 수 있는 고역가, 초순수 NDV를 생산 및 정제하기 위한 상세한 방법이 필요하다.
NDV는 조류 파라믹소 바이러스이기 때문에 배아 된 닭 알에서 가장 자주 증폭됩니다. NDV를 전파하기 위해 이용가능한 세포 기반 시스템이 있지만, 대부분은 배아 닭 난자(18)에서 달성된 것과 유사한 역가를 생산할 수 없었다. 그럼에도 불구하고 계란 기반 생산이 길고 쉽게 확장 할 수 없다는 사실을 포함하여 계란에서 NDV를 생산하는 데는 몇 가지 단점이 있으며, 대량의 SPF 닭고기 달걀을 소싱하는 것이 문제가 될 수 있으며 계란 알레르겐 13,18,19,20으로 오염 될 가능성이 있습니다. . 최근에, 한 그룹은 무혈청 배지에서 현탁액에서 성장한 베로 세포가 정제21 이전에 계란에서 달성된 것과 유사한 역가에 대한 NDV의 복제를 지지할 수 있음을 보여주었다. 그러나, 이러한 바이러스를 베로 세포에 적응시키기 위해 바이러스의 직렬 패시징이 필요하고, 서스펜션 베로 세포로부터 NDV를 정제하는 방법의 최적화가 여전히 요구된다(21).
앞서 강조한 바와 같이, 생체 내 고역가, 생체 등급 바이러스를 정제하는 데 사용되는 방법은 질문22의 바이러스에 따라 다릅니다. 재조합 NDV의 생성에 사용할 수 있는 잘 확립된 역유전학 시스템이 있다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 cDNA 클론, 헬퍼 플라스미드, 및 헬퍼 바이러스의 사용을 수반하는 이 공정은 이전에15,23에서 상세히 기술되었다. 이 프로토콜은 렌토제닉 또는 메소제닉 NDV에 적용될 수 있다. 이 프로토콜에 기재된 바이러스는 바이러스 P와 M 유전자 사이에 삽입된 해파리 빅토리아로부터의 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 재조합 메소제닉 NDV를 개별 전사 유닛으로서 사용하며, 이는 이전에 외래 전이유전자 삽입을 위한 최적의 부위로서 기술되었기 때문에24.
동봉 된 방법은 100 ~ 500 nm의 크기와 밀도15를 기준으로 NDV의 정제를 간략하게 설명합니다. 이것은 약 3 주 내에 생체 등급의 고역가 NDV 스톡의 생성을 허용했으며, 계란이 접수 된 시점부터 최종 역가를 갖는 것까지 시작되었습니다. 접선 유동 여과, 깊이 여과 및 밀도 구배 초원심분리와 같은 계란 기반 바이러스의 대규모 생산에 자주 사용되는 기술이 설명되어 이러한 방법을 더 큰 규모의 생산으로 번역 할 수 있습니다. NDV의 정제를 위한 이전에 기술된 기술들은 바이러스-안정화 완충제의 혼입, 밀도 구배 초원심분리 동안 요오드딕사놀의 사용, 및 생체 등급 품질을 보장하기 위한 다양한 품질 관리 조치의 설명(15)에 의해 개선되었다. 이것은 0.8 내지 1.0 L의 알란토시스 유체에서 3 ×10 10 PFU/mL만큼 높은 역가에 도달하는 생체내 등급 NDV의 정제를 허용하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Slip-Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Povidone Iodine Solution</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14955240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 5/8 in Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>03446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde-PBS</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-14 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (5%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>36-102-0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad, unserrated tipped forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Cassette Holder</td>
			<td>PALL</td>
			<td>CM018V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP101-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet Gel Recovery</td>
			<td>ClearH2O, INC</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>1502W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Candler</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>A46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP82031GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06349-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>ZEISS AXIO</td>
			<td></td>
			<td>Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GiBOX Gel Imager</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td>Imaging of Agarose Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose Dulbecco&#39;s Modified Essential Medium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Kit</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine Monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62929-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>41507-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07522-20</td>
			<td>Peristaltic Pump with digital display</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96420-16</td>
			<td>BioPharm Platinum-Cured Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC Pro 5 Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP950040025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td>SDS-PAGE cast and running appartus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-NDV</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-11633</td>
			<td>Clone 6H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OS100T02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowePac 300</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>50999562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (Pellets)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S318-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific pathogen free eggs</td>
			<td>CFIA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Supplier will vary depending on location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supracap 50 Depth Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>SC050V100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sw41Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SX4750 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>359472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Screw Clamp</td>
			<td>PALL</td>
			<td>88216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utility Pressure Gauges</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>68355-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid

뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 조류 오르토아불라바이러스 혈청형-1로도 알려져 있으며, 종양 용해 바이러스와 바이러스 벡터 백신으로 개발되어 온 부정적인 의미의 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. NDV는 잘 정립 된 역 유전학 시스템, 강력한 면역 자극 특성 및 우수한 안전성 프로파일로 인해 매력적인 치료 및 예방제입니다. 종양 용해 바이러스 또는 바이러스 벡터 백신으로 투여 될 때, NDV는 강력한 항 종양 또는 항원 특이적 면역 반응을 유도하여 면역계의 선천적 및 적응 팔을 모두 활성화시킵니다. 
이러한 바람직한 특성을 감안할 때, NDV는 수많은 임상 시험에서 평가되었으며 가장 잘 연구 된 종양 용해 바이러스 중 하나입니다. 현재 NDV와 관련된 두 가지 등록 임상 시험이 있습니다 : 하나는 SARS-CoV-2 (NCT04871737)에 대한 재조합 NDV 벡터 백신을 평가하고 두 번째는 항 PD-L1 항체 인 Durvalumab (NCT04613492)과 함께 Interleukin-12를 코딩하는 재조합 NDV를 평가하는 것입니다. 이 매우 유망한 바이러스 벡터의 추가 발전을 촉진하기 위해, 생체 등급의 고역가를 생성하기 위한 단순화된 방법, 재조합 NDV (rNDV)가 필요하다. 
이 논문은 특정 병원균 프리 (SPF) 배아 닭 난자에서 rNDV를 증폭하고 동종 요법 유체에서 rNDV를 정제하는 자세한 절차를 설명하며 정화 중 손실을 줄이기위한 개선 사항을 설명합니다. 또한 오염 물질 부족 및 바이러스 무결성을 확인하기 위해 수행해야하는 권장 품질 관리 분석에 대한 설명도 포함되어 있습니다. 전반적으로,이 상세한 절차는 전임상 연구에 사용하기 위해 생체 등급, 재조합, 렌토제닉 및 메소제닉 NDV의 높은 역가의 합성, 정제 및 저장을 가능하게합니다.

알란토익 유체 수확 알란토액은 배아 된 닭 알에서 수확되므로 명확하고 투명하게 보일 것입니다. 유체가 불투명하고 노란색으로 나타나면 이는 오염 물질의 존재를 나타냅니다. 정제 중에이 알란토닉 유체를 포함하면 압력이 빠르게 상승하고 10 psi를 초과하여 바이러스의 전단과 전염성 바이러스의 손실을 초래하므로 정제 과정을 방해합니다. 피 묻은 것처럼 보이는 Allantoic 액체?...

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Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

여기에서 우리는 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산, 정제 및 정량화를 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 프로토콜은 지속적으로 > 6 × 10,9 플라크 형성 단위 / mL를 산출하여 생체 내 동물 연구에 적합한 바이러스 양을 제공합니다. 생체내 안전성을 보장하기 위한 추가의 품질 관리 분석법이 기재되어 있다.

Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

이 프로토콜은 뉴캐슬병 바이러스를 생산하는 데 사용되는 기술을 간략하게 설명하여 쥐 및 햄스터 및 양과 같은 다른 동물에게 안전하게 투여 할 수 있도록합니다. 접선 유동 여과를 사용하면 원심분리 공정만 사용하는 기존 절차에 비해 대량의 시작 부피를 보다 효율적으로 처리할 수 있습니다. 이는 몇 가지 복잡한 단계가 포함된 긴 절차로, 시간 관리가 문제가 될 수 있습니다.모든 잠재적 인 일시 중지 단계를 식별하여 기술을 적절하게 분할하여 스트레스를 최소화 할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조교 인 알렉스 (Alex)가 될 것입니다. 뉴캐슬병 바이러스 또는 NDV의 정제를 위해, 먼저, 이를 통해 50 밀리리터의 PBS를 실행함으로써 이전에 설정된 실험 시스템을 프라임화한다.약 다섯 밀리리터의 PBS가 튜브에 남아 있을 때 펌프를 정지시키십시오. 다음으로, 하나 내지 세 개의 마이크로몰 보유 등급을 갖는 깊이 필터를 튜빙에 부착한다. 필터를 배출하려면 깊이 필터의 에피컬 쪽에 있는 두 번째 캡을 제거한 다음 시스템을 통해 50밀리리터의 PBS를 추가로 실행하기 시작합니다.PBS가 필터 상단의 통풍구를 통해 흐르기 시작하면 포트를 닫고 PBS를 라인을 통해 계속 흐르십시오. 그 후 폐기물 용기를 새로운 멸균 수집 용기로 교체하고 깊이 필터를 통해 Allantoic Fluid를 실행하기 시작하십시오. 다음으로, 접선 유동 여과 또는 TFF 시스템을 공개 확인에서 설정하고 원고에 설명 된대로 실행하십시오.저수지에 약 다섯 밀리리터의 유체가 남아 있으면 펌프를 일시 중지하고 깊이 여과 된 Allantoic Fluid를 저장소에 추가하십시오. 그런 다음 펌프 흐름을 재개하십시오. 바이러스의 전단을 방지하려면 시스템의 압력이 평방 인치당 10 파운드의 힘을 초과하지 않도록하는 것이 중요합니다.환상을 높이려면 연동 펌프와 C 클램프의 속도를 조합하여 사용해야합니다. 150 ~ 100 밀리리터의 Allantoic Fluid가 저장소에 남아 펌프를 일시 중지하고 150 ~ 200 밀리리터의 ML 버퍼를 추가하여 버퍼를 교환합니다. 다시 말하지만, 다섯 ~ 10 밀리리터의 유체가 저수지에 남아있을 때 펌프를 일시 중지 한 다음 두 개의 C 클램프를 사용하여 허리 둘레를 닫습니다.저수지에 공급되는 고정 라인을 분리하고 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 삽입하십시오. 그런 다음 흐름을 재개하고 저수지 탱크에 몇 방울의 유체가 남아 있으면 일시 중지하십시오. 다음으로, 폐기물 라인에서 C 클램프를 제거하고 보유 된 공급 라인을 저수지 탱크에 다시 부착하십시오.한편, 요오드딕사놀 밀도 구배 초원심분리를 준비하기 위해, 먼저 0.5밀리리터의 40% 요오딕사놀을 13.2밀리리터 개방 상부 얇은 벽 울트라 원심분리 튜브에 첨가한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 20 % iodixanol과 2.5 밀리리터의 10 % iodixanol을 연속적으로 첨가하여 컬럼을 준비하십시오. 초원심분리 전에 TFF 시스템에서 암시 된 바이러스 용액 6 ~ 6.5 밀리리터를 구배를 방해하지 않고 요오드딕사놀 컬럼에 조심스럽게 첨가하십시오.초원심분리 후, 한 쌍의 멸균 포셉으로 튜브를 제거하십시오. 대상 밴드는 10과 20% 그라디언트 사이의 큰 밴드여야 합니다. 다음으로, 레토르트 스탠드를 사용하여 튜브를 비이커 상단에 매달아 놓습니다.그 후, 18 게이지의 1.5 인치 바늘을 5 밀리리터 주사기에 부착 한 다음 바늘로 초원심분리 튜브의 측면을 펑크하고 플런저를 천천히 연장하여 대상 밴드를 제거하십시오. 원고에 설명 된대로 바이러스 용액에서 요오드릭사놀을 제거한 후 주사기를 사용하여 바이러스를 투석 카세트에 조심스럽게 주입하십시오. 바이러스 용액을 농축하려면 투석 버퍼에서 투석 카세트를 제거하고 밀봉 가능한 작은 비닐 봉지에 넣으십시오.그런 다음 투석 카세트가 완전히 잠기도록 15 ~ 25 밀리리터의 40 % 폴리에틸렌 글리콜을 가방에 넣으십시오. 투석 후 투석 카세트를 PBS로 간단히 헹구었다. 다음으로, 18 게이지의 1.5 인치 바늘이 장착 된 주사기를 공기로 채우고 주사기를 투석 카세트에 넣고 플런저를 밀어 넣으십시오.도입된 공기 중 어느 것도 제거하지 않고 바이러스를 제거하기 위한 장치를 회전시킨다. 멤브레인에 부착 된 잔류 바이러스를 제거하려면 멤브레인을 손상시키지 않고 장갑을 낀 손가락으로 조심스럽게 마사지하십시오. 하역 과정을 쉽게하려면 투석 카세트에서 과도한 공기 중 일부를 제거하십시오.품질 관리 분석을 위해, 먼저, 1.5 밀리리터 튜브에서 990 마이크로리터의 PBS에 10 마이크로리터를 첨가하여 바이러스 용액을 100배 희석한다. 이어서, 이전 희석액의 100 마이크로리터를 PBS의 900 마이크로리터에 첨가함으로써 연속 희석을 계속한다. 감염 분석을 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰에 각 망상의 20 마이크로리터를 첨가한다.녹색 형광 단백질의 세포 변성 효과를 조사하거나 간접 면역 형광 분석을 수행하기 전에 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 48시간 이상 인큐베이션한다. 이 프로토콜을 사용함으로써, 고도로 정제된 NDV는 바이러스 단백질의 소듐 도설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 입증된 바와 같이 수득되었다. 이 방법에 의해 정제된 바이러스의 감염성은 또한 96 웰 플레이트에서 행해진 50% 조직 배양 감염 용량 또는 TCID50 검정에 의해 검증되었다.TCID50은 Spearman-Karber 계산기를 사용하여 각 희석에 대한 양성 웰의 수로부터 결정되었다. 감염 분석은 10 및 24 시간의 인큐베이션 후 상이한 조건하에서 DF 한 세포에 대한 렌토제닉 및 메소제닉 NDV의 세포변성 효과의 차이를 밝혀냈다. 면역 플로렌스 분석은 또한 렌토제닉 NDV에 의한 베로 세포의 감염을 연구하는데 효과적이었다.실험 시스템을 프라이밍 할 때, 잔류 수산화 나트륨이 바이러스를 불활성화시킬 것이므로 라인이 효과적으로 프라이밍되도록하십시오. 또한 이를 손상시키는 것이 바이러스 정제 및 수율을 현저하게 손상시킬 수 있으므로 막 완전성을 유지하는 것이 중요하다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

연구

암 연구학

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

결합된 조건부 녹다운 및 적응된 구체 형성 분석은 환자 유래 위암 줄기 세포의 줄기 관련 유전자를 연구하기 위하여

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...