Name: production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

J.G.E.Y foi o beneficiário de uma bolsa de doutorado da Faculdade de Veterinária de Ontário e uma bolsa de pós-graduação em Ontário. Este trabalho foi financiado pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants to SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).

Todo o trabalho envolvendo o uso de animais foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Guelph, de acordo com o Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Todo o trabalho é realizado em um laboratório biossegurança nível 2 (BSL2) no Canadá, onde o NDV mesogênico é um Patógeno do Grupo de Risco 2. Todas as etapas envolvidas na amplificação e purificação do NDV devem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica tipo IIA para fins de segurança e esterilidade.
<p class="jo...

<ol>
	<li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li><li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector.">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li><li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy.">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).</li><li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. 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Os vírus utilizados como agentes terapêuticos em estudos pré-clínicos devem ser altamente purificados para evitar a toxicidade quando administrados in vivo15. Se agentes aventureiros ou contaminantes não forem removidos, isso pode levar a reações adversas graves negando o efeito terapêutico do agente viral28. Como o NDV é produzido em ovos de galinha embrionados, existem várias proteínas de ovos contaminantes, como a ovalbumina, que devem ser removidas a...

O Newcastle Disease Virus, também conhecido como Ortoavulavírus-1, é um paramyxovírus aviário envolto com potencial para ser usado tanto como um vírus oncolítico quanto como uma vacina viralvetorial 1,2,3,4,5,6,7. Mais recentemente, o NDV projetado para expressar a proteína de pico de SARS-CoV-2 tem sido caracterizado como uma vacina intranasal eficaz nos modelos de desafio de camundongos ehamsters 7,8,9. Quando usado como imunoterapia contra o câncer, resulta no recrutamento de células imunes inatas, especificamente células assassinas naturais, produção de interferon tipo I, e a geração de células T específicas do antitumoral 10,11,12,13. Além dessas potentes propriedades imunoestimulatórias, o NDV possui um forte perfil de segurança e um sistema genético reverso bem estabelecido14,15. Essas características desejáveis têm solicitado a avaliação do NDV em numerosos ensaios clínicos pré-clínicos e humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Para avançar ainda mais este vetor viral altamente promissor e estimulante imunológico, métodos detalhados são necessários para produzir e purificar ndv ultra-puro de alta titer que pode ser administrado com segurança in vivo.
Como o NDV é um paramyxovírus aviário, é mais frequentemente amplificado em ovos de galinha embrionados. Embora existam sistemas baseados em células disponíveis para propagação de NDV, a maioria não foi capaz de produzir títulos semelhantes aos alcançados em ovos de galinha embrionados18. No entanto, existem algumas desvantagens na produção de NDV em ovos, incluindo o fato de que a produção à base de ovos é longa e não facilmente escalável, a fonte de grandes quantidades de ovos de galinha SPF pode ser problemática, e existe o potencial de contaminação com alérgenos de ovos 13,18,19,20 . Recentemente, um grupo mostrou que as células Vero cultivadas em suspensão em meio livre de soro podem suportar a replicação de NDV para titers comparáveis aos obtidos em ovos, antes da purificação21. No entanto, isso exigiu a passagem serial do vírus para adaptar o vírus às células Vero, e a otimização de um método para purificar o NDV das células Vero suspensas ainda é necessária21.
Como destacado anteriormente, os métodos utilizados para purificar o vírus de alto nível, in vivo de grau, variam dependendo do vírus na questão22. Existe um sistema genético reverso bem estabelecido disponível para a geração de NDV recombinante. Este processo, envolvendo o uso de um clone cDNA, plasmídeos auxiliares e um vírus auxiliar que expressa polimerase T7 RNA, foi descrito anteriormente em detalhes15,23. Este protocolo pode ser aplicado a NDV lentogênico ou mesogênico. O vírus descrito neste protocolo é um NDV mesogênico recombinante codificando a proteína fluorescente verde (GFP) da água-viva Aequorea victoria inserida entre genes P e M virais como uma unidade de transcrição individual, pois este foi descrito anteriormente como o local ideal para a inserção de transgenesestrangeiros 24.
Os métodos fechados descrevem a purificação do NDV com base em seu tamanho, variando de 100 a 500 nm, e sua densidade15. Isso permitiu que a geração de estoques NDV de alto nível e alto nível em aproximadamente 3 semanas, a partir de quando os ovos são recebidos até ter um título final. São descritas técnicas frequentemente utilizadas na produção em larga escala de vírus à base de ovos, como filtração de fluxo tangencial, filtração de profundidade e ultracentrifugação de gradiente de densidade, permitindo a tradução desses métodos para uma produção em maior escala. Técnicas descritas anteriormente para a purificação do NDV foram aprimoradas pela incorporação de um tampão estabilizador de vírus, uso de iodixanol durante a ultracentrifugação de gradiente de densidade e pela descrição de várias medidas de controle de qualidade para garantir a qualidade in vivo 15. Isso permitiu a purificação de NDV de grau vivo atingindo títulos de até 3 × 1010 PFU/mL de 0,8 a 1,0 L de fluido allantóico.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Slip-Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Povidone Iodine Solution</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14955240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 5/8 in Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>03446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde-PBS</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-14 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (5%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>36-102-0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad, unserrated tipped forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Cassette Holder</td>
			<td>PALL</td>
			<td>CM018V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP101-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet Gel Recovery</td>
			<td>ClearH2O, INC</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>1502W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Candler</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>A46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP82031GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06349-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>ZEISS AXIO</td>
			<td></td>
			<td>Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GiBOX Gel Imager</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td>Imaging of Agarose Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose Dulbecco&#39;s Modified Essential Medium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Kit</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine Monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62929-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>41507-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07522-20</td>
			<td>Peristaltic Pump with digital display</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96420-16</td>
			<td>BioPharm Platinum-Cured Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC Pro 5 Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP950040025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td>SDS-PAGE cast and running appartus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-NDV</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-11633</td>
			<td>Clone 6H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OS100T02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowePac 300</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>50999562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (Pellets)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S318-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific pathogen free eggs</td>
			<td>CFIA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Supplier will vary depending on location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supracap 50 Depth Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>SC050V100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sw41Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SX4750 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>359472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Screw Clamp</td>
			<td>PALL</td>
			<td>88216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utility Pressure Gauges</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>68355-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid

O vírus da doença de Newcastle (NDV), também conhecido como sorotipo-1 ortoavulavírus aviário, é um vírus de RNA de uma única faixa que foi desenvolvido tanto como um vírus oncolítico quanto uma vacina viral vetorial. O NDV é um agente terapêutico e profilático atraente devido ao seu sistema genético reverso bem estabelecido, propriedades imunostimulatórias potentes e excelente perfil de segurança. Quando administrado como um vírus oncílico ou uma vacina viral vetorial, o NDV provoca uma resposta imune robusta ou específica de antígeno, ativando os braços inatos e adaptativos do sistema imunológico. 
Dadas essas características desejáveis, o NDV tem sido avaliado em inúmeros ensaios clínicos e é um dos vírus oncolíticos mais bem estudados. Atualmente, existem dois ensaios clínicos registrados envolvendo NDV: um avaliando uma vacina recombinante de NDV vetored para SARS-CoV-2 (NCT04871737), e um segundo avaliando um NDV recombinante codificando Interleukin-12 em combinação com Durvalumab, um anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar o avanço desse vetor viral altamente promissor, são necessários métodos simplificados para gerar ndv de alto nível, in vivo e recombinante (rNDV). 
Este artigo descreve um procedimento detalhado para amplificar o rNDV em ovos de galinha embrionados sem patógenos especificados (SPF) e purificar o rNDV do fluido allantóico, com melhorias para reduzir a perda durante a purificação. Também estão incluídas descrições dos ensaios de controle de qualidade recomendados, que devem ser realizados para confirmar a falta de contaminantes e integridade do vírus. No geral, este procedimento detalhado permite a síntese, purificação e armazenamento de alto título, in vivo-grau, recombinante, lentogênico e mesogênico NDV para uso em estudos pré-clínicos.

Colheita de fluido allantóico Como o fluido allantóico é colhido de ovos de galinha embrionados, deve parecer claro e transparente. Se o fluido parecer opaco e amarelo, isso indica a presença de contaminantes. A inclusão desse fluido allantóico durante a purificação impedirá o processo de purificação, pois a pressão aumentará rapidamente e ultrapassará 10 psi, resultando na cisalhamento do vírus e perda do vírus infeccioso. Fluido allantóico que parece sangrento sugere que os ovos for...

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Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para produção, purificação e quantificação do vírus recombinante da doença de Newcastle. Este protocolo rende consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placas/mL, fornecendo quantidades de vírus apropriadas para estudos in vivo em animais. Ensaios adicionais de controle de qualidade para garantir a segurança in vivo são descritos.

Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Este protocolo descreve as técnicas usadas para produzir o Newcastle Disease Virus para que possa ser administrado com segurança para camundongos e outros animais, como hamsters e ovelhas. O uso da filtragem de fluxo tangencial permite que grandes volumes iniciais sejam processados de forma mais eficiente em comparação com os procedimentos existentes que utilizam apenas processos de centrifugação. Este é um procedimento demorado envolvendo várias etapas complexas, o que significa que o gerenciamento do tempo pode ser um problema.Recomendo identificar todos os passos potenciais de pausa para que a técnica possa ser dividida adequadamente, minimizando o estresse. Demonstrando este procedimento estará Alex, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Para a purificação do Newcastle Disease Virus ou NDV, primeiro, prime o sistema experimental previamente definido executando 50 mililitros de PBS através dele.Pare a bomba quando aproximadamente cinco mililitros de PBS forem deixados no tubo. Em seguida, conecte um filtro de profundidade com uma classificação de retenção de um a três micromolars à tubulação. Para desovendar o filtro, remova a segunda tampa do lado epical do filtro de profundidade e comece a executar mais 50 mililitros de PBS através do sistema.Uma vez que o PBS começa a fluir através da ventilação na parte superior do filtro, feche a porta e continue a fluir PBS através das linhas. Depois disso substitua o vaso de resíduo por um novo vaso de coleta estéril e comece a executar o fluido allantóico através do filtro de profundidade. Em seguida, configure a filtragem de fluxo tangencial ou sistema TFF em uma confirmação aberta e executada conforme descrito no manuscrito.Quando restam cerca de cinco mililitros de fluido no reservatório, pare a bomba e adicione o fluido allantóico filtrado de profundidade ao reservatório. Em seguida, retome o fluxo da bomba. Para evitar o estalação do vírus, é importante garantir que a pressão do sistema não exceda a força de 10 libras por polegada quadrada.Para aumentar a ilusão, deve-se usar uma combinação da velocidade da bomba peristáltica e do grampo C. 150 a 100 mililitros de fluido allantóico são deixados no reservatório, pausam a bomba e trocam o buffer adicionando 150 a 200 mililitros de tampão ML. Novamente, pare a bomba quando cinco a 10 mililitros de fluido são deixados no reservatório, em seguida, usando dois grampos C fechar a linha da cintura.Desacoplar a linha retented alimentando o reservatório e inseri-lo em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, retome o fluxo e pare quando houver poucas gotas de fluido no tanque do reservatório. Em seguida, remova os grampos C das linhas de resíduos e recoloque a linha de alimentação retented ao tanque do reservatório.Enquanto isso, para se preparar para a ultracentrifugação de gradiente de densidade idixanol, primeiro adicione um tubo de ultra centrífugas de 0,5 mililitros de 40% iodixanol a um tubo ultra centrífugo de parede fina de 13,2 mililitros. Em seguida, prepare a coluna com sucessivas adições de 2,5 mililitros de 20% iodixanol, e 2,5 mililitros de 10% iodixanol. Antes da ultracentrifugação, adicione cuidadosamente seis a 6,5 mililitros da solução de vírus aludindo do sistema TFF à coluna iodixanol sem perturbar o gradiente.Após a ultracentrifugação, remova os tubos com um par de fórceps estéreis. A banda-alvo deve ser uma grande banda entre os 10 e 20% gradientes. Em seguida, suspenda o tubo sobre o topo de um béquer usando um suporte de réplica.Depois disso, conecte uma agulha de 1,5 polegadas de calibre 18 a uma seringa de cinco mililitros e, em seguida, puna o lado do tubo ultracentrífuga com a agulha e remova a faixa alvo, estendendo lentamente o êmbolo. Depois de remover iodixanol da solução do vírus como descrito no manuscrito, use uma seringa para injetar cuidadosamente o vírus em um de diálise. Para concentrar a solução do vírus, remova o de diálise do tampão de diálise e coloque-o em um pequeno saco plástico vedado.Em seguida, adicione um 15 a 25 mililitros de 40% de polietileno glicol ao saco para que o de diálise fique completamente submerso. Após a diálise enxague brevemente o de diálise com PBS. Em seguida, encha uma seringa equipada com uma agulha de 1,5 polegadas com ar, insira a seringa no de diálise e empurre o êmbolo.Gire o aparelho para remover o vírus sem remover nenhum ar introduzido. Para desalojar o vírus residual aderindo à membrana, massageie cuidadosamente a membrana com dedos enluvados sem danificá-la. Para facilitar o processo de desalojador, remova parte do excesso de ar no de diálise.Para ensaios de controle de qualidade, primeiro, diluir a solução do vírus 100 vezes adicionando 10 microliters dele a 990 microliters de PBS em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, continue a diluição serial adicionando 100 microliters da diluição anterior a 900 microliters de PBS. Para ensaios de infecção, adicione 20 microliters de cada ilusão a cada poço de uma placa de 96 poços.Antes de examinar o efeito citopático da proteína de fluorescência verde, ou realizar um ensaio indireto de imunofluorescência, incubar a placa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por pelo menos 48 horas. Utilizando este protocolo, o NDV altamente purificado foi obtido como demonstrado pela eletroforese de gel de poliacrilamida de sódio das proteínas virais. A infectividade do vírus purificada por este método também foi verificada pela dose de infecção por cultura de tecido de 50% ou ensaio TCID50 feito em 96 placas de poço.O TCID50 foi determinado a partir do número de poços positivos para cada diluição usando a calculadora Spearman-Karber. O ensaio de infecção revelou a diferença entre os efeitos citopáticos do NDV lentogênico e mesogênico em DF uma células em diferentes condições após 10 e 24 horas de incubação. O ensaio imuno florence também foi eficaz no estudo da infecção das células Vero pelo NDV lentogênico.Ao priming o sistema experimental, certifique-se de que as linhas são preparadas efetivamente como qualquer hidróxido de sódio residual irá inativar o vírus. Também é importante manter a integridade da membrana, pois comprometer isso prejudicará significativamente a purificação e o rendimento do vírus.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Pesquisa do câncer

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Um modelo de xenoenxerto Murine Ommaya para estudar terapia direta da doença leptomeningeal

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...