Name: production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

J.G.E.Y recibió una beca de doctorado de la Facultad de Veterinaria de Ontario y una beca de posgrado de Ontario. Este trabajo fue financiado por Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (subvención # 304737) y LS (subvención # 401127).

Todo el trabajo que involucra el uso de animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Todo el trabajo se realiza en un laboratorio de Nivel 2 de Bioseguridad (BSL2) en Canadá, donde el VEN mesogénico es un patógeno del grupo de riesgo 2. Todos los pasos involucrados en la amplificación y purificación del VEN deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica Tipo IIA para fines de seguridad y esterilidad.
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Los virus utilizados como agentes terapéuticos en estudios preclínicos deben ser altamente purificados para evitar toxicidad cuando se administran in vivo15. Si no se eliminan los agentes adventicios o contaminantes, esto puede conducir a reacciones adversas graves que nieguen el efecto terapéutico del agente viral28. Como el VEN se produce en huevos de gallina embrionados, existen varias proteínas contaminantes del huevo, como la ovoalbúmina, que deben elimin...

El virus de la enfermedad de Newcastle, también conocido como ortoavulavirus aviar-1, es un paramixovirus aviar envuelto con el potencial de ser utilizado como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viral 1,2,3,4,5,6,7. Más recientemente, el VEN diseñado para expresar la proteína espiga del SARS-CoV-2 se ha caracterizado como una vacuna intranasal efectiva en modelosde desafío de ratón y hámster 7,8,9. Cuando se usa como inmunoterapia contra el cáncer, resulta en el reclutamiento de células inmunes innatas, específicamente células asesinas naturales, producción de interferón tipo I y la generación de células T antitumorales específicas 10,11,12,13. Además de estas potentes propiedades inmunoestimulantes, el VEN tiene un fuerte perfil de seguridad y un sistema de genética inversa bien establecido14,15. Estas características deseables han impulsado la evaluación del VEN en numerosos ensayos clínicos preclínicos y humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Para avanzar aún más en este vector viral inmunoestimulador altamente prometedor, se necesitan métodos detallados para producir y purificar el VEN ultrapuro de alto título que se puede administrar de manera segura in vivo.
Como el VEN es un paramixovirus aviar, se amplifica con mayor frecuencia en los huevos de gallina embrionados. Si bien existen sistemas basados en células disponibles para propagar el VEN, la mayoría no ha podido producir títulos similares a los logrados en los huevos de gallina embrionados18. Sin embargo, existen algunos inconvenientes en la producción de VEN en los huevos, incluido el hecho de que la producción a base de huevos es larga y no fácilmente escalable, el abastecimiento de grandes cantidades de huevos de gallina SPF puede ser problemático, y existe el potencial de contaminación con alérgenos de huevo 13,18,19,20 . Recientemente, un grupo ha demostrado que las células Vero cultivadas en suspensión en medio libre de suero pueden soportar la replicación del VEN a títulos comparables a los logrados en los óvulos, antes de la purificación21. Sin embargo, esto requirió el paso en serie del virus para adaptar el virus a las células Vero, y la optimización de un método para purificar el VEN de las células Vero en suspensión todavía se requiere21.
Como se destacó anteriormente, los métodos utilizados para purificar el virus de alto título e in vivo varían según el virus en cuestión22. Existe un sistema de genética inversa bien establecido disponible para la generación de VEN recombinante. Este proceso, que implica el uso de un clon de ADNc, plásmidos ayudantes y un virus ayudante que expresa ARN polimerasa T7, ha sido descrito previamente en detalle15,23. Este protocolo se puede aplicar al VEN lentogénico o mesogénico. El virus descrito en este protocolo es un NDV mesogénico recombinante que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria insertada entre los genes virales P y M como una unidad de transcripción individual, ya que este ha sido descrito previamente como el sitio óptimo para la inserción de transgenes extraños24.
Los métodos cerrados describen la purificación del VEN en función de su tamaño, que varía de 100 a 500 nm, y su densidad15. Esto ha permitido la generación de existencias de VEN de alto título de grado in vivo en aproximadamente 3 semanas, desde que se reciben los huevos hasta que se tienen un título final. Se describen las técnicas utilizadas con frecuencia en la producción a gran escala de virus a base de huevos, como la filtración de flujo tangencial, la filtración de profundidad y la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que permite la traducción de estos métodos a una producción a mayor escala. Las técnicas descritas anteriormente para la purificación del VEN se han mejorado mediante la incorporación de un tampón estabilizador de virus, el uso de iodixanol durante la ultracentrifugación del gradiente de densidad y la descripción de diversas medidas de control de calidad para garantizar la calidad de grado in vivo 15. Esto ha permitido que la purificación del VEN de grado in vivo alcance títulos tan altos como 3 × 1010 PFU / ml de 0.8 a 1.0 L de líquido alantoico.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Slip-Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Povidone Iodine Solution</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14955240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 5/8 in Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>03446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde-PBS</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-14 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (5%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>36-102-0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad, unserrated tipped forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Cassette Holder</td>
			<td>PALL</td>
			<td>CM018V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP101-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet Gel Recovery</td>
			<td>ClearH2O, INC</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>1502W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Candler</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>A46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP82031GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06349-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>ZEISS AXIO</td>
			<td></td>
			<td>Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GiBOX Gel Imager</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td>Imaging of Agarose Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose Dulbecco&#39;s Modified Essential Medium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Kit</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine Monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62929-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>41507-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07522-20</td>
			<td>Peristaltic Pump with digital display</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96420-16</td>
			<td>BioPharm Platinum-Cured Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC Pro 5 Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP950040025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td>SDS-PAGE cast and running appartus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-NDV</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-11633</td>
			<td>Clone 6H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OS100T02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowePac 300</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>50999562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (Pellets)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S318-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific pathogen free eggs</td>
			<td>CFIA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Supplier will vary depending on location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supracap 50 Depth Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>SC050V100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sw41Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SX4750 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>359472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Screw Clamp</td>
			<td>PALL</td>
			<td>88216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utility Pressure Gauges</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>68355-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid

El virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), también conocido como serotipo 1 del ortoavulavirus aviar, es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo que se ha desarrollado como un virus oncolítico y una vacuna vectorizada viralmente. El VEN es un agente terapéutico y profiláctico atractivo debido a su sistema genético inverso bien establecido, potentes propiedades inmunoestimulantes y excelente perfil de seguridad. Cuando se administra como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viralmente, el VEN provoca una respuesta inmune antitumoral o antígeno robusta, activando los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario. 
Dadas estas características deseables, el VEN ha sido evaluado en numerosos ensayos clínicos y es uno de los virus oncolíticos mejor estudiados. Actualmente, hay dos ensayos clínicos registrados que involucran el VEN: uno que evalúa una vacuna recombinante vectorizada por el VEN para el SARS-CoV-2 (NCT04871737), y un segundo que evalúa un NDV recombinante que codifica la interleucina-12 en combinación con Durvalumab, un anticuerpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar un mayor avance de este vector viral altamente prometedor, se necesitan métodos simplificados para generar UN VEN (rNDV) recombinante de alto título, de grado in vivo. 
Este documento describe un procedimiento detallado para amplificar el rNDV en huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados (SPF) y purificar el rNDV a partir de líquido alantoico, con mejoras para reducir la pérdida durante la purificación. También se incluyen descripciones de los ensayos de control de calidad recomendados, que deben realizarse para confirmar la falta de contaminantes y la integridad del virus. En general, este procedimiento detallado permite la síntesis, purificación y almacenamiento de VEN de alto título, de grado in vivo, recombinante, lentogénico y mesogénico para su uso en estudios preclínicos.

Recolección de líquido alantoico Como el líquido alantoico se cosecha de huevos de gallina embrionados, debe parecer claro y transparente. Si el fluido aparece opaco y amarillo, esto indica la presencia de contaminantes. La inclusión de este fluido alantoico durante la purificación impedirá el proceso de purificación, ya que la presión aumentará rápidamente y superará los 10 psi, lo que resultará en el cizallamiento del virus y la pérdida del virus infeccioso. El líquido alantoico que pa...

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Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción, purificación y cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título. Este protocolo produce consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placa/ml, proporcionando cantidades de virus apropiadas para estudios in vivo en animales. Se describen ensayos de control de calidad adicionales para garantizar la seguridad in vivo .

Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para producir el virus de la enfermedad de Newcastle para que pueda administrarse de forma segura a ratones y otros animales como hámsters y ovejas. El uso de la filtración de flujo tangencial permite que los grandes volúmenes de partida se procesen de manera más eficiente en comparación con los procedimientos existentes que utilizan solo procesos de centrifugación. Este es un procedimiento largo que implica varios pasos intrincados, lo que significa que la gestión del tiempo puede ser un problema.Recomendaría identificar todos los posibles pasos de pausa para que la técnica se pueda dividir adecuadamente, minimizando el estrés. Demostrando este procedimiento estará Alex, un asistente de investigación de mi laboratorio. Para la purificación del virus de la enfermedad de Newcastle o NDV, primero, prepare el sistema experimental previamente establecido ejecutando 50 mililitros de PBS a través de él.Detenga la bomba cuando queden aproximadamente cinco mililitros de PBS en el tubo. A continuación, conecte un filtro de profundidad con una clasificación de retención micromolar de uno a tres al tubo. Para ventilar el filtro, retire la segunda tapa en el lado epical del filtro de profundidad y luego comience a ejecutar 50 mililitros adicionales de PBS a través del sistema.Una vez que el PBS comience a fluir a través de la ventilación en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe fluyendo PBS a través de las líneas. Después de eso, reemplace el recipiente de desechos con un nuevo recipiente de recolección estéril y comience a pasar el líquido alantoico a través del filtro de profundidad. A continuación, configure el sistema de filtración de flujo tangencial o TFF en una confirmación abierta y ejecute como se describe en el manuscrito.Cuando queden unos cinco mililitros de líquido en el depósito, detenga la bomba y agregue líquido alantoico filtrado en profundidad al depósito. A continuación, reanude el flujo de la bomba. Para evitar el cizallamiento del virus, es importante asegurarse de que la presión del sistema no exceda la fuerza de 10 libras por pulgada cuadrada.Para aumentar la ilusión, se debe usar una combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y la abrazadera C. Se dejan de 150 a 100 mililitros de líquido alantoico en el depósito, pausa la bomba e intercambia el tampón agregando de 150 a 200 mililitros de tampón ML. Una vez más, detenga la bomba cuando queden de cinco a 10 mililitros de líquido en el depósito, luego use dos abrazaderas en C para cerrar la cintura.Desacople la línea retenida que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego reanude el flujo y haga una pausa cuando queden pocas gotas de líquido en el tanque del depósito. A continuación, retire las abrazaderas C de las líneas de residuos y vuelva a conectar la línea de alimentación retenida al tanque del depósito.Mientras tanto, para prepararse para la ultracentrifugación del gradiente de densidad de iodixanol, primero agregue un tubo de ultra centrífuga de pared delgada de 0.5 mililitros de 40% de iodixanol a un tubo de ultra centrífuga de pared delgada de 13.2 mililitros. Luego prepare la columna con adiciones sucesivas de 2.5 mililitros de iodixanol al 20% y 2.5 mililitros de iodixanol al 10%. Antes de la ultracentrifugación, agregue cuidadosamente de seis a 6,5 mililitros de la solución de virus aludida desde el sistema TFF a la columna de iodixanol sin alterar el gradiente.Después de la ultracentrifugación, retire los tubos con un par de pinzas estériles. La banda objetivo debe ser una banda grande entre los gradientes de 10 y 20%. A continuación, suspenda el tubo sobre la parte superior de un vaso de precipitados con un soporte de retorta.Después de eso, conecte una aguja de 1.5 pulgadas de calibre 18 a una jeringa de cinco mililitros, luego perfore el costado del tubo de la ultracentrífuga con la aguja y retire la banda objetivo extendiendo lentamente el émbolo. Después de extraer el iodixanol de la solución del virus como se describe en el manuscrito, use una jeringa para inyectar cuidadosamente el virus en un casete de diálisis. Para concentrar la solución de virus, retire el cassette de diálisis del tampón de diálisis y colóquelo en una pequeña bolsa de plástico sellable.Luego agregue de 15 a 25 mililitros de polietilenglicol al 40% a la bolsa para que el cassette de diálisis quede completamente sumergido. Después de la diálisis, enjuague brevemente el cassette de diálisis con PBS. A continuación, llene una jeringa equipada con una aguja de 1,5 pulgadas de calibre 18 con aire, inserte la jeringa en el cassette de diálisis y empuje el émbolo.Gire el aparato para eliminar el virus sin eliminar el aire introducido. Para desalojar el virus residual que se adhiere a la membrana, masajee cuidadosamente la membrana con los dedos enguantados sin dañarla. Para facilitar el proceso de desalojo, retire parte del exceso de aire en el cassette de diálisis.Para los ensayos de control de calidad, primero, diluya la solución del virus 100 veces agregando 10 microlitros a 990 microlitros de PBS en un tubo de 1.5 mililitros. Luego continúe la dilución en serie agregando 100 microlitros de la dilución anterior a 900 microlitros de PBS. Para los ensayos de infección, agregue 20 microlitros de cada ilusión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.Antes de examinar el efecto citopático de la proteína de fluorescencia verde, o realizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante al menos 48 horas. Mediante el uso de este protocolo, se obtuvo un NDV altamente purificado como lo demuestra la electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio de las proteínas virales. La infectividad del virus purificado por este método también se verificó mediante la dosis de infección de cultivo de tejidos del 50% o el ensayo TCID50 realizado en 96 placas de pozos.El TCID50 se determinó a partir del número de pocillos positivos para cada dilución utilizando la calculadora Spearman-Karber. El ensayo de infección reveló la diferencia entre los efectos citopáticos del VEN lentogénico y mesogénico en células DF en diferentes condiciones después de 10 y 24 horas de incubación. El ensayo immuno florence también fue efectivo en el estudio de la infección de las células Vero por el VEN lentogénico.Al preparar el sistema experimental, asegúrese de que las líneas estén cebadas de manera efectiva, ya que cualquier hidróxido de sodio residual inactivará el virus. También es importante mantener la integridad de la membrana, ya que comprometer esto afectará significativamente la purificación y el rendimiento del virus.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Un modelo de xenoinjerto murino de Ommaya para estudiar la terapia dirigida directamente de la enfermedad leptomeningeal

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...